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96-孔肾小序测定检测血清样品的钙化倾向

A Pasch (1) W Jahnen-Dechent (2) (1)伯尔尼大学(2)RWTH AACHEN大学 07/2013
  • 心血管疾病与血管钙化有关
  • Fetuin-A是一个强大的钙化抑制剂
  • 测定可以应用于来自患者和健康个体的血清样本

介绍

钙离子(CA.2+)人体使用磷酸盐来构建骨骼和牙齿的结构材料。所得结晶磷酸钙是钙化过程的产物。CA的浓度2+磷酸盐在大多数组织和体液中接近过饱和度,并且由于沉淀可能发生在体内的任何地方。在健康的人中,这通常不是这种情况,因此可以理解的是必须非常严格地监管钙化过程。如果该调节不正常,钙化也可以在软组织或血管中进行,导致例如导致。对心血管疾病,世界各地最占优势的死因。


血清蛋白Fetuin-A是有效的钙化抑制剂。与额外的血液成分一起,Fetuin-A将防止CA2+尽管过饱和,但磷酸盐沉淀物。代替小胶体蛋白质 - 矿物络合物。这些初级钙键颗粒(CPP)将自发地转化为晶体二级CPP,同时改变形状和粒径。过渡以定时和协调的方式发生,并且被认为反映给定流体的内在抑制钙化倾向。在本申请中,我们描述了一种测量从初级到血清样品中的初级CPP过渡的测试。通过检测与其相关的激光散射的变化,该基于标签的96孔板的测定法测量初级至二级CPP的转化。我们使用了nephelostar®来自BMG Labtech的微孔板读卡器。德赢vwin官网客服

测定原则

激光产生的光束通过样本。溶液中的粒子将散射光,这取决于粒子的大小和/或形状。主CPP和次CPP有不同的形状和颗粒直径使霞石星来测量这两种状态。前向散射光以高达80度的角度探测到。


材料与方法

  • NEPHELOstar,B德赢vwin官网客服MG Labtech.
  • 清盘器96台式移液系统,梅特勒 - 托莱多透明品牌的96孔板
  • 96孔粘性塑料盖板,来自CALLICHEM,SIGMA或ROTH的所有化学品

血清样本
测定来自健康志愿者的血清样本以及血液透析患者的血清样品。已经表明,经过血液透析的患者增加了加速血管和软组织钙化的风险。小鼠血清由DBA / 2 Fetuin-a缺陷( - / - ),杂合(+/-)和野生型(+ / +)小鼠制备。


微孔板制备
所有液体都使用Liquidator96台式移液系统按以下顺序进行移液(量为一口井)

  • 20μLNaCl溶液(140mM NaCl)
  • 80μl血清
  • 用振动器搅拌1分钟
  • 50μL磷酸溶液(19.44mM Na2HPO4+4.56毫米24+100 mm Hepes + 140 mm NaCl pH调节,在37°C时用10米NaOH调节至7.40)
  • 用振动器搅拌1分钟
  • 50μL钙溶液(40mM CaCl2+100 mm Hepes + 140 mm NaCl pH调节,在37°C时用10米NaOH调节至7.40)
  • 用振动器搅拌1分钟
  • 使用粘合片盖96孔板

NEPHELOstar仪表设置
将板放入Nephelostar并使用以下参数读取:

板模式: 动力学
没有循环: 200.
测量时间: 1.5秒
周期: 180秒/周期
定位延迟: 0.1秒
激光束焦点: 1.5毫米
激光强度: 50%

总检测运行时间为10小时,但有些措施也更长。为了最小化测量过程中的温度波动,关闭内部肾上腺素温度控制,并在恒温间在34.5°C的恒温室中进行所有测量,导致Nephelostar的内部温度为36.5-37°C。


成绩与讨论

使用三维动态光散射(3D-DLS),我们确定了用于主CPP和辅助CPP的流体动力半径RH。在含有Fetuin-A,磷酸盐和CA的试验溶液中测量CPP直径2+以及血清样本。结果的直径非常相似(初级CPPs在60至75 nm之间,而次级CPP在120至150 nm之间),但显示出显著不同的转变时间(在血清样本中延迟)。我们的结论是转换步骤的延迟可以与初级CPP的稳定性有关,测量这一步将有助于确定血清样本固有的抑制效能。测定方法的优化和所有的进一步测定都是用霞石星进行的。图2显示了从初级CPP到次级CPP随时间变化的测量结果。

测量后,将数据导出到Excel和GraphPad Prism进行数据评估。半半的过渡时间(t50.)和半个最大肾小球单元(RNU50.)的计算结果(图2)。为了验证实验的有效性,对小鼠和人的样本进行了测定。图3显示,该方法可区分野生型小鼠血清和胎蛋白a缺陷型小鼠血清。浊度测定结果与这些小鼠的钙化负荷观察结果一致。

人血清样品是从健康的供体和血液透析患者获得的。图。图4显示了两个组的结果。

该试验再次能够区分两个供体组,表明该试验用于测量人类血清样本的效用。我们的结果表明,浊度计测试是有用的测量钙化倾向的体液合理的样品吞吐量。


结论

我们的测试是一种基于新的96孔尼触线计的测定,测量血清中的整体钙化风险。由于钙化是在许多疾病中经常观察到的过程,该测定可用于临床和基础研究。试验的常规临床使用需要评估前瞻性研究。


专利申请中。如有问题并避免知识产权侵权,请联系info@calcisco.com.

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