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对PHERAstar FS进行DELFIA时间分辨荧光细胞介导的细胞毒性试验

NM Patterson T. Cunningham X. Jiang DJ Shapiro 伊利诺伊大学 06/2009
  • 通过HTS阅读器分析96孔格式的铕时间分辨荧光细胞毒性分析
  • 本文的数据表明,雌激素显着降低了NK92天然杀伤细胞诱导的细胞死亡
  • 这种时间分辨荧光法被证明是一种替代放射性铬释放法的方法

表的内容

介绍

雌激素是通过雌激素受体在人类细胞中发挥核内和核外作用的类固醇激素。通过这种方式,雌激素促进了不同的细胞过程,如人类癌症的增殖和转移;此外,雌激素已被证明在肿瘤中发挥作用,发展了阻断免疫监视的能力。免疫监测的结果主要是自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T淋巴细胞(ctl)诱导肿瘤细胞凋亡。这些溶细胞淋巴细胞(CLs)使用穿孔素和含颗粒酶颗粒。颗粒酶B (GrB)被认为在颗粒酶介导的细胞毒性诱导靶细胞裂解中起主导作用。


结果表明,在乳腺癌细胞中,随着雌激素浓度的增加,颗粒酶B抑制剂和SerpinB9/蛋白酶抑制剂9 (PI-9)水平升高,NK92自然杀伤细胞诱导的细胞死亡逐渐被阻断。有几种方法可用来监测细胞凋亡和其他形式的细胞死亡。这些检测主要关注凋亡过程中发生的变化——膜联蛋白V和碘化丙啶检测基于膜特性和通透性的变化,TUNEL检测基于凋亡相关的DNA片段化。

这些方法和其他方法在评估同质细胞群中的细胞凋亡时非常有效,但当存在混合细胞时,在评估只有一种细胞类型的细胞凋亡时就不那么有用了。混合细胞群中细胞死亡的一个常见例子发生在免疫监视过程中,免疫系统的细胞,如细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和自然杀伤细胞(NK),诱导靶细胞凋亡。在混合细胞群中分析细胞凋亡通常需要将感兴趣的细胞预先装入试剂,而在细胞死亡过程中发生的膜完整性的丧失导致试剂被释放。最广泛使用的测定方法是用放射性标记的铬预加载细胞。然而,51Cr是一个不稳定的光子发射器,为了安全使用,需要昂贵而笨重的铅屏蔽。


在这里聚特罗拉特®FS.HTS微孔板阅读器用于时间分辨荧光分析研究膜完整性的损失。在本实验中,靶细胞中载入荧光增强配体BATDA, BATDA快速穿透细胞膜,水解形成亲水配体(hydrophilic ligand, TDA),细胞溶解后才释放出来(图1)。


在一个包含欧盟的解决方案存在的情况下3 +,释放的TDA形成高度荧光和稳定的螯合物(EuTDA),其水平是测量的。结果表明,该方法的测定结果与经典的铬释放测定方法相似。

测定原理

BATDA会通过靶细胞的细胞膜。细胞内的酯酶裂解酯键,形成不能通过细胞膜的亲水配体(TDA)。效应细胞将其靶细胞识别为外来细胞并启动细胞溶解过程。细胞溶解后TDA释放,离心后发现TDA存在于上清液中。在200 μl的Eu中加入20 μl的上清3 +在pherstar上测量得到的高时间分辨荧光信号的溶液FS.

材料与方法

  • 96孔V-底部黑色微孔板
  • DELFIA®EuTDA细胞毒性试剂包括BATDA试剂、裂解缓冲液和铕溶液、PerkinElmer
  • PHERAstarFS., 德赢vwin官网客服BMG LABTECH

细胞介导的细胞毒性试验是按照制造商的协议进行的,只是做了一些修改。靶细胞(MCF-7,人乳腺癌细胞)在106细胞/mL无酚MEM和5% cd小牛血清中与BATDA室温孵育10分钟,然后洗4次。


然后将靶细胞与效应细胞以不同的效应细胞/靶细胞(E/T)比例混合。细胞毒性实验在96孔含10000个靶细胞的v型底板上进行,总体积为200 μL/孔。以1000 rpm离心30秒,使靶细胞与效应细胞接触。


孵育2小时后,将来自每次反应的上清液(20μl)加入200μl的欧盟中3 +解决方案。

搅拌5分钟后,使用应用特异性DELFIA测量时间分辨荧光®模组的激发波长为337 nm,发射波长为615 nmFS.标仪。


计算
具体裂解百分数计算如下:

自发释放
将靶细胞与培养基而不是效应细胞一起温育。


最大限度的释放
靶细胞用裂解缓冲液而不是效应细胞孵育。


结果与讨论

使用所述的时间分辨荧光试验,检测荧光底物从失去膜完整性的细胞释放,雌激素处理24小时显著减少了NK92细胞诱导的细胞死亡(图2)。

蛋白酶抑制剂9 (PI-9)抑制颗粒酶B, NK细胞通过颗粒酶途径杀伤靶细胞。然而,雌激素的多种作用增加了雌激素的其他作用可能与阻断NK细胞诱导的细胞毒性有关的可能性。为了探讨PI-9在雌激素介导的抗NK细胞诱导的细胞毒性作用中所起的作用,我们采用RNAi技术下调PI-9的表达。PI-9特异性siRNA敲除PI-9后,雌激素抑制NK92细胞诱导杀伤的能力减弱(图3)。这些数据表明,雌激素抑制NK细胞介导的MCF-7细胞溶解的能力源于其诱导PI-9的能力。

结论

与DELFIA®细胞毒性测定法FS.研究NK细胞介导的细胞溶解是可能的。数据表明雌激素的增加和细胞溶解的减少之间有明确的关系。此外,还表明雌激素通过蛋白酶抑制剂-9保护MCF-7细胞。

DELFIA是PerkinElmer的商标。

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