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测量p-糖蛋白(PGP)抑制的快速简便方法

Donald L. Melchior(1)Frances J. Sharom(2)EJ戴尔(3) (1)氟体公司(2)圭尔夫大学(3)BMG实验室德赢vwin官网客服 04/2010
  • 的Fluorosome®- 劳动 -PGP荧光强度测定特异性测量抑制p-糖蛋白多药转运蛋白
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech的略微镀胶读卡器,用于设置荧光动力学测量

表的内容

介绍

22 (Pgp;ABCB1)是ATP结合盘(ABC)超家族的成员之一,在ATP水解驱动下从细胞中输出结构多样的疏水化合物。Pgp的表达与人类癌症化疗药物的外流有关,从而导致多药耐药。Pgp活性也可导致低口服吸收和低脑渗透。药物与Pgp的相互作用也可能导致共给药化合物的毒性增加。


药物与PGP等活性转运蛋白的相互作用对药业行业的利益越来越大,基于新的FDA指南,需要了解药物候选者是否是PGP的基材和/或抑制剂。


荧光体公司的荧光体®-trans-PGP测定与BMG Labtech的微孔板读者一起德赢vwin官网客服提供快速,灵敏和特异的重构PGP脂质体测定系统,用于鉴定与转运蛋白相互作用的化合物。测定测量化合物与PGP底板进行运输的能力,并确定IC50价值。读取器在测量点注入的能力确保了数据不会丢失。高达每秒50个读数,同时注射,提供样品数据计算一阶传输速率。单浓度抑制测量可以非常迅速地进行,并且可以进行集成电路50由此仅在10分钟内进行的测定。

测定原理

材料与方法

PGP是170kDa内在膜蛋白,其从细胞中排出各种药物。PGP也是荧光磷脂和糖磷脂衍生物向外的唾液糖,这表明它还可以将药物分子与外膜叶片翻译。膜脂双层在PGP功能中起重要作用,可以调节药物的结合和运输。


PGP的分离和纯化
纯化的PGP(> 90%)与PGP过度表达CH分离R.用洗涤剂(CHAPS)提取B30细胞,然后用Con A-Sepharose进行亲和层析。将胶束Pgp与chaps溶解的胶束磷脂混合,重组成脂质双分子层,并用凝胶排斥层析法去除洗涤剂。重组后的Pgp可以在-70°C冷冻保存。

制造Fluorosome -transpgp
冷冻重组Pgp解冻,与荧光团(bsa -荧光素)混合在缓冲液中,然后转化为氟体-trans-PGP通过挤压。通过凝胶排阻色谱法将所得的单层囊泡与未封闭的荧光团分离。含氟微血体 -trans-pgp应遵守质量控制标准;控制Pgp底物的大小、荧光、被动渗透性和atp刺激的转运。


含氟微血体 -trans-PGP分析程序

1.96孔半孔板的每孔加入98 μl氟体反式pgp,缓冲液中含有3 μM底物S-HR。
2.加入2μL试样的试验化合物的DMSO溶液。在稀释到井中的7个浓度之一中,每个等分等分等分等分等分等分等分等分等分等分的试验化合物,所需的化合物的所需浓度。坯料,参考孔(无化合物)具有2μLDMSO。
3.将平板置于微孔板阅读器中,在485/520下监测荧光60秒如下:
一个。在前18秒内建立荧光基线;
b. 18秒时,每孔注入缓冲液中ATP溶液5 μl(终浓度为2mm),监测荧光42秒;
C。通过BMG LabTech的MARS数据分析软件立即计算30至60秒的斜率。德赢vwin官网客服

图2给出了随时间测量的荧光信号的典型图像。

结果与讨论

绘制每个孔的斜率(图2)绘制测试化合物的浓度和IC50通过使用稳健适用于单个订单衰减来计算值(图3和4)。

含氟微血体的相关性 -trans-pgp IC50数据和细胞单层IC50数据
我知道了50数值以μM浓度给出。双向运输抑制研究进行了同一套化合物与氟体测定trans-pgp检测,示例如图5所示。双向传输抑制研究采用lc - mdr1细胞单层和[3H]地高辛(0.1 μM)作为底物。

结果使用含氟微血体 -trans-pgp测定方法与细胞培养法的结果非常一致。


结论

我们报告了一种用于测量p-糖蛋白多药片(PGP; ABCB1)的抑制的新型测定法,以及用于其使用的理想仪器。

  • 简单的测定程序:无菌条件,非化合物特异性,无放射性标记或LC质谱
  • 特异性:Fluorosome®-Trans-PGP仅包含p-糖蛋白转运蛋白
  • 低样本要求:100 μl体积的氟体®-Trans-PGP试剂每个测定需要1个纳米摩尔药物
  • 速度:每次抑制试验1分钟-例如8分的IC50检测+ 2次引用仅需10分钟
  • 流行的形式:96孔半孔或384孔微孔板,每孔抑制试验
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