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表观遗传酶组蛋白脱乙酰酶1的基于荧光测定(HDAC1)

Patricia Haus Franz-Josef Meyer-Almes 达姆施塔特大学应用科学 02/2012
  • HDAC引起的组蛋白修饰与转录的表观遗传调控密切相关
  • HDAC抑制剂(HDIS)是癌症治疗中可能的策略
  • 在BMG Labtech的微孔板读卡器上进行荧光HDAC活性和抑制剂测定德赢vwin官网客服

介绍

乙酰化等翻译后组蛋白修饰在转录的表观遗传调控中起着关键作用。催化后一种反应,hdac影响各种细胞过程,特别是癌变。虽然表观遗传事件引发癌变的机制尚未得到明确解释,但抑制HDACs已被强调为癌症治疗的一个可行原则。抑制HDACs会导致组蛋白过乙酰化,进而导致受控细胞死亡(凋亡)。一些HDAC抑制剂(hdi)正处于I期或II期临床试验,例如亚eroylanilide羟肟酸(SAHA;ZOLINZA®,默克)。在过去几年中,研究重点是选择性HDI的发展。为了确定具有重组蛋白质的抑制作用荧光测定可以提供有价值的性能。在本申请说明中,BMG Labtech的荧光微孔板读卡器用于确定SAHA对HDAC1的抑制剂效果。德赢vwin官网客服


测定原则

通过两步酶测定法施加HDAC1活性的测定。ε-乙酰化赖氨酸部分的原理碱基对HDAC引起的基材Boc-Lys(AC)-AMC的脱乙酰化。在第二步骤中,通过胰蛋白酶切割去乙酰化底物,导致氟因尼菌(7-氨基-4-甲基伞素;图1)释放。

材料与方法

  • 微孔板读者(BMG Labtech,O德赢vwin官网客服rtenberg,德国)
  • 黑色96孔半区域板(Greiner Bio-One) HDAC1 (BPS Bioscience)
  • Boc-Lys(AC)-AMC(Bachem)
  • 牛胰蛋白酶(Sigma)
  • 萨哈(Cayman Chemical Company)
  • FB188缓冲液(15 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KH24./ K.2HPO.4.,250mM NaCl,250μmEDTA和0.001%Pluronic F-68)

K的评价mHDAC1的价值
确定km使用不同衬底浓度的值测量在FB188缓冲液中进行。在第一步中,将HDAC1(4.5nm最终浓度)与底物Boc-Lys(AC)-AMC(初始衬底浓度为512μm)的串联稀释孵育。在30°C胰蛋白酶(1.7mg / ml)和Saha(5μm)孵育1小时后,以停止反应并释放荧光AMC(激励过滤器:340/10,发射过滤器:460/10)。


评估IC50.萨哈与HDAC1的价值

在进行1:3连续稀释(初始值35μm)后,在室温下与Saha温育15分钟,在室温下与Saha温育15分钟。在第二步骤中加入底物,终浓度为20μm,然后在30℃下孵育1小时。胰蛋白酶(1.7mg / ml)和Saha(5μm)完成反应,AMC直接测量。

成绩与讨论

Km通过使用不同的底物浓度确定HDAC1的值(图2)。


每个数据点对应于额外的动力测量。RFU(相对荧光单元)值是达到酶促反应平衡后最后5个数据点的平均值。由此产生的K.m值为58.89 μM。在K之后m评估在已知的HDAC1 Inihbitor(Saha)存在下进行测定。虽然底物浓度严格为10μm,但抑制剂在35μm和0.002μm的范围内使用(图3)。

使用Saha作为抑制剂的两步活性测定,导致IC50值为374nm。


结论

使用来自BMG Labtech的微孔板读卡器测定重组HDAC1的活性HDAC1的活性提供高精度和性能。德赢vwin官网客服使用Boc-Lys(AC)-AMC已经表明,宽范围的衬底浓度导致稳定的可检测信号。此外,测定允许测定对HDAC同种型1,2,3和6以及细菌组蛋白脱乙酰化酶样酰胺的抑制作用Bordetella / Alcaligenes.菌株FB188。

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