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基于荧光的表观遗传酶组蛋白去乙酰化酶1 (HDAC1)的检测

Patricia Haus Franz-Josef Meyer-Almes 达姆施塔特大学应用科学 02/2012
  • HDAC引起的组蛋白修饰与转录的表观遗传调节强烈相关
  • HDAC抑制剂(HDIS)是癌症治疗中可能的策略
  • 在BMG Labtech的微孔板读卡器上进行荧光HDAC活性和抑制剂测定德赢vwin官网客服

介绍

乙酰化等翻译后组蛋白修饰在转录的表观遗传调控中发挥着关键作用。HDACs催化后一种反应,影响各种细胞过程,特别是癌变过程。虽然通过表观遗传事件启动癌变的机制尚不清楚,但抑制HDACs已成为癌症治疗中一个可行的原则。抑制HDACs导致组蛋白过度乙酰化,进而导致可控的细胞死亡(凋亡)。一些HDAC抑制剂(hdi)正在进行I期或II期临床试验,例如亚甲酰苯胺羟肟酸(SAHA;ZOLINZA®默克公司)。在过去的几年里,研究集中在选择性hdi的开发上。用荧光法测定重组蛋白的抑制效果是一种有价值的方法。在本应用笔记中,使用来自BMG LABTECH的荧光酶标仪来测定SAHA对HDAC1的抑制作用。德赢vwin官网客服


测定原则

HDAC1活性的测定采用两步酶法。该原理基于HDAC引起底物Boc-Lys(Ac)-AMC去乙酰化的ε-乙酰化赖氨酸片段。在第二步中,去乙酰化的底物被胰蛋白酶裂解,从而释放荧光蛋白AMC(7-氨基-4-甲基香豆素;图1)。

材料与方法

  • Microplate阅读器(BMG L德赢vwin官网客服ABTECH, Ortenberg,德国)
  • 黑色96孔半面积板(Greiner Bio-One) HDAC1 (BPS Bioscience)
  • Boc-Lys (Ac) amc (Bachem)
  • 牛胰腺胰蛋白酶(Sigma)
  • 萨哈(Cayman Chemical Company)
  • FB188缓冲液(15 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KH24/ K.2HPO4,250mM NaCl,250μmEDTA和0.001%Pluronic F-68)

K的计算HDAC1的价值
来确定K在FB188缓冲液中使用不同底物浓度进行值测量。第一步HDAC1(最终浓度4.5 nM)与1:2的底物Boc-Lys(Ac)-AMC(初始底物浓度512 μM)连续稀释孵育。30°C培养1小时后,加入胰蛋白酶(1.7 mg/mL)和SAHA (5 μM),以停止反应并释放荧光AMC(激发过滤器:340/10,发射过滤器:460/10)。


集成电路的评估50.萨哈与HDAC1的价值

在进行1:3连续稀释(初始值35μm)后,在室温下与Saha温育15分钟,在室温下与Saha温育15分钟。在第二步骤中加入底物,终浓度为20μm,然后在30℃下孵育1小时。胰蛋白酶(1.7mg / ml)和Saha(5μm)完成反应,AMC直接测量。

结果与讨论

K通过使用不同的底物浓度确定HDAC1的值(图2)。


每个数据点对应一个额外的动力学测量。RFU (relative fluorescence unit)值为酶反应达到平衡后最后5个数据点的平均值。结果K测定值为58.89 μM。K之后检测是在已知的HDAC1抑制因子(SAHA)存在下进行的。当底物浓度严格控制在10 μM时,抑制剂的使用范围在35 μM到0.002 μM之间(图3)。

以SAHA为抑制剂进行两步活性测定,IC50为374 nM。


结论

使用BMG LABTECH的酶标仪在荧光底物上测定重组HDAC1的活性,具有较高的精度和性能。德赢vwin官网客服使用Boc-Lys(Ac)-AMC已经证明,一个广泛的底物浓度范围可以产生稳定的可检测信号。此外,该方法还可测定对HDAC亚型1、2、3和6以及细菌组蛋白去乙酰化酶样氨基水解酶HDAH的抑制作用Bordetella / Alcaligenes.菌株FB188。

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