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一种高通量、均匀性、基于微位移的检测膜结合酶(MraY)活性的方法

亚当·B·夏皮罗(1) (1)阿斯利康(2)BMG实验室德赢vwin官网客服 07/2013
  • 肽聚糖合成抑制剂代表抗菌药物靶点
  • 建立了一种基于微磁共振的检测方法来寻找MraY抑制剂
  • pherstar的同时双发射探测能力®FS提高高通量

表的内容

介绍

肽聚糖是细菌细胞壁的重要结构成分。肽聚糖的连续合成和细胞壁的重塑是大多数细菌所必需的。由于磷酸- n -乙酰基muramoyl-五肽转移酶(MraY)催化肽聚糖生物合成的最后一个细胞质步骤,它代表了抗菌药物的目标。这个完整的膜蛋白催化可溶性udp - n -乙酰- muramoyl五肽(UNAM-pp)与脂质十一烯丙基磷酸(C55P)的结合,并与膜结合。


测定原理

在本应用笔记中,我们想提出一种新的基于微磁共振的检测方法来监测MraY的活性。供体荧光团(BODIPY-FL)附着在UNAM-pp (B-UNAM-pp)上,受体荧光团标记为1,2-二棕榈酰sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺- n -(lissaminerhodamine B sulfonyl) (LRPE),嵌在胶束中,胶束中也含有MraY和脂质底物C55P(图1)。

MraY转位酶活性将B-UNAM-pp附着在C55P上,使FRET受体和供体靠近彼此。在485 nm处激发会导致能量转移,减少供体荧光(520 nm处)和增加受体荧光(590 nm处)。


材料与方法

  • PHERAstarFSmicroplate阅读器(BMG L德赢vwin官网客服ABTECH)
  • 光模块(Ex:485 nm;新兴市场:520/590)
  • 化学品是从商业来源获得的
  • 嗯,小体积黑色聚苯乙烯板(Matrix Tech)

UNAM-pp的制备及MraY基因的克隆、表达大肠杆菌以及随后的膜制备大肠杆菌文献中描述过MraY的过度表达。


含0.06% Triton X-100, C55P和大肠杆菌含有MraY的膜预孵育30分钟,加入3 mL B-UNAM-pp +/- UMP启动反应。反应缓冲液包括(最终浓度):50毫米三氯化钾(pH 7.5), 100毫米氯化钾,50毫米氯化镁2, 1毫米二硫苏糖醇和0.05% Triton X-100。最终反应物浓度:20 mM C55P, 50 mg/mL膜蛋白,2µM B-UNAM-pp, 0-24µM LRPE和0或5 mM UMP。


在室温下进行三次MraY分析。荧光被激发,同时双发射测量,在焦距10.6毫米的情况下,每个读数使用20次闪烁。每分钟测量1小时,平均三次。


为了检测室温保存的效果,MraY检测试剂置于室温暗箱中,在0.5M海藻糖存在或不存在的情况下保存。试剂在室温下存放0、2.5、5小时后混合,重复三次F590/ F520数据采集于1小时的时间点。Z的计算可以从有(MAX)和没有(MIN)膜的样品中得到。

为研究衣卡霉素的抑菌作用,实验采用含16µM LRPE、0或15µg/mL mray的抑菌剂大肠杆菌膜蛋白,0.1µM B-UNAM-pp和10µM C55P测定缓冲液中含有0.5 M海藻糖。用检测缓冲液稀释土霉素,并从有膜的平均进展曲线中减去无膜的平均进展曲线,得到D(F590/ F520)和DF520测量。抑制率和IC50年代的计算。


结果与讨论

当反应暴露在485nm荧光激发下时,观察到520的时间依赖性下降和590发射的增加(数据未显示)。使用比率测量是因为它们比单个荧光强度测量有更少的噪声(图2)。这是由于消除了同样影响两种测量的波动。比例变化随时间的增加而增加,且随LRPE的增加而增加。

当反应在存在5毫米UMP的情况下进行时,荧光比的变化可以忽略不计(数据未显示)。在没有UMP的情况下,随着时间的推移,荧光比明显增加(图2)。这一效应表明,检测中观察到的信号是由MraY反应引起的。


研究了海藻糖作为一种糖稳定剂在室温下储存试剂的效果。图3显示,在室温下保存2.5小时后,Z’值就会下降。然而,0.5 M海藻糖的加入会阻碍这一效果。

用tunicamycin研究了该方法对抑制的敏感性(图4)50测量使用Δ(F590/ F520)的浓度较低,且随反应时间的增加幅度较小ΔF520


结论

与先前报道的方法相比,这种方法有几个优点。第一:它不使用放射性同位素,所以不需要特殊的训练、处理和处置。第二:它在光谱的可见光部分使用激发波长的供体荧光团,而不是紫外部分。这减少了来自测试化合物的自荧光和吸收的干扰。最后:使用受体和供体荧光强度发射比供体激发产生更高的精度的FRET分析。


的使用Δ(F590/ F520) /ΔF520由于对抑制有较大的敏感性,抗抑制敏感性损失和较高的信噪比而具有优势。此外,大于0.7的Z '表明这种方法将适合于高吞吐量屏幕。

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