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高通量,均匀,基于FRET的测定检测膜结合酶(MRAY)活性

Adam B Shapiro(1)Carl Peters(2) (1)AstraZeneca(2)BMG德赢vwin官网客服 Labtech 07/2013
  • 肽聚糖合成的抑制剂代表抗菌药物靶标
  • 开发了一种基于FRAT的测定以找到MRAY抑制剂
  • Pherastar的同时双发射检测能力®FS.增强高吞吐量

介绍

肽聚糖是细菌细胞壁的重要结构组分。肽聚糖的持续合成和细胞壁的重塑对于大多数细菌至关重要。由于酶Phosho-N- acteylmuramoyl-肽磷酰倍丙酯(MRAY)催化肽聚糖生物合成中的最后一种细胞质步骤之一,它代表抗菌药物的靶标。这种整体膜蛋白催化可溶性UDP-N-乙酰甲酰胺基肽(UNAM-PP)与膜结合的脂质不赤皂基酯(C55P)的附着。


测定原则

在本申请中,我们希望提出一种新的基于均匀的FRET的测定来监测MRAY的活动。在受体荧光团标记的1,2-Dipalmitoyl-中,将供体荧光团(BODIPY-FL)连接到UNAM-PP(B-UNAM-PP)上- 甘油-3-磷乙酰氯甲酰基 - 叠层 - N-(Lissaminerhodamine B磺酰磺酰)(LREPE)嵌入胶束中,该胶束还含有MRAY和脂基底族C55p(图1)。

MRAY易位式活动将将B-UNAM-PP连接到C55P,使FRET受体和捐赠者彼此接近。485nm的激发将导致能量转移,减少供体荧光(在520nm处)并增加受体荧光(590nm)。


材料与方法

  • Pherastar.FS.微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服
  • 光学模块(例如:485 NM; EM:520/590)
  • 从商业来源获得化学品
  • 384孔,低体积,黑色,聚苯乙烯板(Matrix Tech)

制备UNAM-PP和克隆,MRAY表达E.coli.以及随后的后续制备膜E.coli.过表达的MRAY在文献中描述。


含有0.06%Triton X-100,C55P和的6μL混合物E.coli.将含MRAY的膜预孵育30分钟。添加3ml B-UNAM-PP +/-UMP发起反应。反应缓冲液由(最终浓度)组成:50mM Tris-HCl(pH7.5),100mM KCl,50mM MgCl2,1mM二硫代噻唑和0.05%Triton X-100。反应物的最终浓度:20mM C55P,50mg / mL膜蛋白,2μMB-UNAM-PP,具有0-24μmLRPE和0或5mm UMP。


在室温下进行三份MRAY测定。荧光被激发,并且使用20张闪光测量的同时双发射,每个读数在焦距10.6mm处。每分钟进行测量为1小时,平均时间课程平均。


为了在室温下测试储存的效果,MRAY测定试剂在暗中储存在黑暗中,在存在或不存在0.5M海藻糖中。在室温下储存0.5和5小时后混合试剂并三份F.590./F520.数据在1小时的时间点收集。然后可以从具有(最多)和没有(min)膜的样品中获得z'计算。

为了研究胞苷抑制,反应含有16μm的LRPE,0或15μg/ mL MRAY的含量大肠杆菌膜蛋白,0.1μMB-UNAM-PP和10μMC55P在含有0.5M海藻糖的测定缓冲液中。用测定缓冲液稀释Tunicamycin,并从具有膜的平均进化尿液中减去没有膜的平均进展曲线,以获得D(f590./F520.)和DF.520.测量。百分比抑制和IC50.计算。计算。


成绩与讨论

当反应暴露于485nm的荧光激发时,观察到520的时间依赖性降低,并且观察到590个发射的增加(数据未显示)。使用比例测量比单独的荧光强度测量更少(图2)。这是由于消除了同样影响两种测量的波动。比率变化随时间和LRPE依赖方式的增加。

当在5mM UMP存在下进行反应时,荧光比的变化可以忽略不计(数据未示出)。在没有UMP的情况下,随时间观察到荧光比大增加(图2)。该效果表明在测定中观察到的信号是由于MRAY反应。


还评估了海藻糖,糖稳定剂在室温下储存试剂的影响。图3显示,当测定在室温下储存时,Z'值降低少于2.5小时。然而,加入0.5米海藻糖阻断这种效果。

使用unicicamycin研究该测定对抑制的敏感性(图4)。结果表明IC50.使用使用δ.(F590./F520.)较低,并随比测量的时间表现出的增加。δ.F520.


结论

该测定与先前报道的这些测定有几个优点。首先:它不需要放射性同位素,因此不需要特殊培训,处理和处置。其次:它使用施主荧光团,在可见的可见波长中具有激发波长而不是紫外线部分。这减少了从测试化合物自动荧光和吸收的干扰。最后:使用受体和供体荧光强度的比例的FRET测定在供体激励上产生更高的精度。


指某东西的用途δ.(F590./F520.) 超过δ.F520.由于对抑制,对抑制敏感性损失的更大敏感性以及抑制的敏感性以及更高的信噪比,是有利的。此外,大于0.7的Z'表示该方法适用于高吞吐量屏幕。

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