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在BMG Labtech微孔板读卡器上进行白细胞粘附测定德赢vwin官网客服

Da桑德斯DS Charnock-Jones 剑桥大学 03/2009
  • 白细胞粘附试验用于筛选潜在的炎症标志物
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器用于基于电池的底部光学测量和井扫描
  • 结果显示出良好的再现性,可以调整为例如:初级嗜中性粒细胞

表的内容

介绍

炎症反应的一个关键组成部分是白细胞的募集和外渗进入血管周围组织。这一过程需要白细胞与血管内皮相互作用,包含多个步骤,包括捕获循环中的白细胞,随后白细胞滚动、停止、牢固粘附和迁移(图1)。

该复杂过程最初涉及内皮细胞粘附分子与白细胞上的特定配体的识别和相互作用。捕获和从流动血液中除去白细胞,以及随后沿着容器壁滚动白细胞,是由于在白细胞和内皮细胞表面上发现的选择汀的可逆结合。白细胞对内皮细胞对内皮细胞的粘附和坚定的粘附性取决于在白细胞细胞表面上的MAC-1或LFA-1中的B2整合蛋白的激活,然后与属于免疫珠蛋白超家族的内皮细胞蛋白相互作用,例如ICAM-1。


我们使用基因监管网络识别参与人脐细胞(HUVEC)中炎症反应的新型调节中心基因。为了评估这些基因的潜在作用,我们使用过白细胞粘附测定来模拟该复杂过程,并在所选基因的RNAi敲击后查看内皮的响应。我们使用了主要外周血单核细胞(PBMC)和许多白细胞细胞系(HL60,JY和U937),其在其粘附配体中不同。


所有的测量都是使用来自BMG LABTECH的多模酶标仪进行的。德赢vwin官网客服

材料与方法

这些材料购自下列制造商:

  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器
  • siRNA靶向试剂来自达尔马康,Perbio
  • 细胞追踪器绿色染料来自Invitrogen微孔板,黑色96孔来自Greiner
  • 来自Lonza的组织培养基
  • HL60。ECACC的Ast和JY细胞系
  • 来自研发系统的TNFA重组蛋白

HUVECs在EGM2培养基中生长,每次实验合并10个供体的细胞池。细胞从冷冻储存中恢复后培养24小时,并被镀到T25组织培养瓶中。使用100nm siRNA on-target plus pool进行转染,转染6小时后将细胞重新接种到96孔板中。为了使目标蛋白被敲除,在正常生长条件下转染细胞48小时。然后用多道移液管轻轻清洗盘子。选择的井中加入EGM2培养基+/-TNFa。培养皿孵育4小时,使细胞粘附分子上调,然后用PBS轻洗一次。


在用TNFa孵育HUVECs的同时,使用细胞追踪器绿(2.5 μM PBS)标记HL60细胞(或其他白细胞细胞),在37°C下按照生产说明标记25分钟。标记和洗涤后,将HL60重悬于EGM2中,然后加入除未标记细胞加入的阴性对照孔外的所有孔(1 × 105/孔)。


平板孵育1小时使白细胞粘附,然后在RT下用PBS轻轻清洗x3以去除任何未结合的细胞。然后使用BMG LABTECH微孔板阅读器(激发485 nm,发射520 nm)对每孔的荧光进行定量,每个样品重德赢vwin官网客服复5次。以敲除TNFRSF1A作为阳性对照。

结果与讨论

初步结果表明,细胞数量与荧光呈线性关系(图2)。

然后用转染siRNA的荧光素酶(siControl)和TNFRSF1A(阳性对照)的HUVECs建立初步粘附试验。转染48小时后,细胞用TNFa (0-10 ng/mL)处理4小时,然后加入细胞跟踪器绿色标记的HL60细胞。在孵育1小时后,轻轻地清洗以去除未附着的HL60,使用BMG LABTECH微孔板阅读器在荧光模式下,底部光学测量荧光定量。德赢vwin官网客服图3显示的结果表明,在未治疗和控制KD条件下,TNFa浓度的增加导致HL60对HUVEC单层的粘附增加。然而,在siRNA敲除TNFRSF1A后,TNFa对HL60黏附没有显著影响。这是可以预测的,因为这个受体是TNFa信号传递所必需的。

QPCR研究证实敲除效率为>90%。这是一个非常有价值的阳性对照试验,并用于所有后续研究。BMG LABTECH微孔板阅读器的孔扫描模式有助于将该实验德赢vwin官网客服扩大到48孔板,因为由于HL60细胞可能不均匀分布,它可以确保准确的定量。该函数还为96孔板中的化验结果提供了良好的可视化输出,如下图4所示。

将结果与荧光显微镜分析的孔相比较(数据未显示)。这显示了非常相似的模式,但是使用微孔板阅读器能够快速分析多个微孔板,而不是用显微镜耗时的图像捕获和定量。


结论

结果表明,复杂的生物测定的良好再现性,并提供了一种快速筛选炎症过程的这种方面的方法。我们利用该方法筛选多种潜在的炎症标记,并且提供了一种非常易于使用的技术,如果需要更多“体内”测定,也可以适用于初级中性粒细胞或PBMC。

Cell Tracker Green是Invitrogen的注册商标

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