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基于光谱吸光度的高通量方法的pH确定方法

Andrew Witschi(1)Carl Peters(2) (1)Hudson Robotics Inc.,Springfield,NJ(2)BMG L德赢vwin官网客服abtech,Cary,NC 04/2019
  • 溴素醇蓝的光谱吸光度数据,在光谱上收集纳米表现出pH依赖性
  • 溴和中性形式的菠萝啉醇蓝的pH变化可用于创建标准曲线

介绍

由于其对酶活性和其他生物和化学应用的影响,准确测定pH是重要的1。然而,使用电极的数据收集与采用微孔板读取器的高吞吐量方法不兼容。


在这里,我们描述了一种基于光谱仪的方法,该方法采用了光谱纳米。我们使用基于酚类染料溴酚醇蓝,其理想地适用于比色测定在生理范围内研究pH。该方法允许快速准确的pH测量,可以轻松地与Hudson的Solo自动化移液器和Micro 10x分配器一起放置,用于板材制备。通过包括来自Hudson的PlateRane EX机器人臂可以获得完整的自动化。


测定原则

Bromothymol Blue是一种酚类染料,其用作溶液中的弱酸。在其上助催促的基本条件下,这种环形的形式是蓝色的,并且在620nm左右的光和吸收光(图1;右侧)。中性,环形形式是黄色的,在400和430nm之间显示出吸光度最大值(图1;左侧)。

材料与方法

  • Solo自动化液化仪和10x分配器(哈德森)
  • 384孔,底板(UV透明,剑杆)
  • 光谱纳米
  • 从商业来源获得的菠萝啉醇蓝和pH标准缓冲液

实验程序
使用Solo自动化移液机和微量10x分配器制备板。向每个孔中加入前20μL溴酚醇蓝。随后,加入80μl的每种标准。每个标准使用五种重复,表示从pH6到7.8的范围。用光谱读取板纳米使用以下设置。

仪器设置

视镜设置 吸光度,光谱
波长范围(踩踏)NM 220-1000(1)
常规设置 闪光次数: 200.
安定时间: 1.0秒

使用BMG Labtech的MARS软件进行数据分析。德赢vwin官网客服


成绩与讨论

图2显示了PH 7标准的光谱测量结果。在该样品中,您可以在618nm和420nm处看到基本和中性形式的基本和中性形式的吸光度最大值。

对于溴素醇蓝的基本形式,在最大值(618nm)上绘制OD与pH值产生的标准曲线,其对应于4个参数fi t(图3)。

许多研究人员使用溴素醇蓝的基本形式的吸光度来确定未知的pH值。但是,改变焦距的任何变体都可以将误差引入测量的OD。因此,我们探讨了利用中性形式的菠萝酚蓝中看到的变化的可能性。


图4显示了在320和500nm之间获得的光谱的覆盖层。由于pH增加,最大OD减小,随着最大值的波长,可以看出最大值的波长。

图5显示绘制中性形式与pH的最大吸光度也适用于pH预测。

结论

使用Bromothymol Blue的基本形式或中性形式提供等效预测未知样品的pH值。初步数据(未示出)表明使用中性形式改善了计算的pH值的%CV。光谱纳米和火星数据分析能够快速简便地分析中性形式。


参考

1.王,j等人。分析酶活性pH依赖性的图解方法。Biochim。Biophys。Acta(1999)1435:177-183。

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