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一种基于蛋白质的信使rna生物传感器

亚历山大厨师Christopher P. Toseland 英国肯特大学生物科学学院 12/2018
  • 单链结合蛋白(SSB)是能够结合和量化mRNA的合适生物传感器
  • 荧光MDCC-SSB生物传感器与高通量、未纯化的mRNA兼容
  • 的CLARIOstar®微孔板读数器检测与RNA结合的MDCC-SSB的流动倒数增加

表的内容

介绍

转录,由RNA聚合酶催化,是活细胞中最基本的过程之一(1)。描述酶的过程或用于CRISPR的RNA生成需要定量RNA转录本。这通常需要核酸的纯化,导致实验的不准确性和产物的损失。合成荧光染料是可以买到的,但是比较贵。在这里,我们描述了基于单链结合(SSB)蛋白(2)的荧光生物传感器的使用,这已经被建立为一种ssDNA生物传感器(2)大肠杆菌并且可以在不需要事先纯化RNA的情况下使用,从而提供了一种成本低、易于使用的mRNA测量替代方法。


测定原理

SSB结合65-70个碱基长度的ssDNA作为四聚体蛋白质。结合位点的长度表示生物传感器的极限分辨率。

材料与方法

  • 来自美国Nunc的黑色96孔微孔板。# 7605
  • Clariostar.®德赢vwin官网客服BMG LABTECH,德国。
  • MDCC来自英国Invitrogen公司。# D10253
  • 大肠杆菌SSB G26C, Addgene,美国质粒# 78203。ssRNA70欧陆坊,英国
  • hiscribe t7 RNA合成套件(NEB)

所有其他试剂均由英国Sigma Aldrich公司提供

实验程序

  • 用MDCC的SSB纯化和标记

按照Dillingham等人(1)和Cook等人(2)的方法表达、纯化并用MDCC标记SSB蛋白。

  • 低聚核苷酸的MDCC-SSB滴定(校准)

所有反应均在25°C包含50 mM Tris的缓冲液中进行。HCl pH 7.5, 3mm MgCl2100 mM NaCl和200 nM MDCC-SSB,最终体积为100µL。SSB是一种四聚体蛋白,因此生物传感器的浓度为50nm。测量时,在10-20口井中注入100µl MDCC-SSB。序列稀释100µl的2µM ssRNA70。然后计算相对于MDCC-SSB仅控制的荧光变化。测量是在CLARIOstar microplate阅读器上进行的,设置如下。

  • 在体外转录和mRNA定量

在体外使用HiScribe T7 RNA合成试剂盒进行转录。控制模板生成2225个碱基的径流记录。反应在30°C进行20 120分钟。使用RNeasy对mRNA进行纯化®套件。一半的样品用于RT-QPCR量子与Qualifast Sybr Green QPCR套件。将剩余的样品转移到微孔板中并与MDCC-SSB混合,并在上述测定条件混合。


仪器设置

视镜设置 荧光光谱,顶视光谱
单色仪的设置 前。400-10-> 440-10 / 470-16
Em。430 - 10/455 10 - > 550 - 10
获得 在测量之前调整
焦点高度
一般设置 数量的闪光 40
沉淀时间 0.1秒

结果与讨论

当与SSRNA结合时,MDCC-SSB FORECENTEM发射增加2.1倍70(图2)。


MDCC-SSB的荧光取决于ssRNA的浓度70当所有的生物传感器都与底物结合时就会饱和(图3)。MDCC-SSB生物传感器(200 nM)在5-500 nM两个数量级的线性范围内检测mRNA。在这个线性范围内,生物传感器可以根据SSB结合位点的浓度进行校准。

在体外由T7启动子驱动的T7聚合酶的转录产生了2225个核苷酸的转录。不同反应时间(20 ~ 120 min)的转录测定得到不同数量的mRNA产物。产物纯化后,将MDCC-SSB添加到每个mRNA样本中,记录MDCC-SB与转录产物的结合(图4)。荧光强度与mRNA量的线性响应表明生物传感器检测转录产物产量的差异。

为了增加生物传感器的多功能性,我们测试了是否需要mRNA纯度。我们发现MDCC-SSB与纯度和非纯化mRNA结合(图5)。后者通过隔离步骤防止产品损失。在图3中执行滴定。如图3所示,在SSB结合位点,使得生物传​​感器可以产生定量数据来实现待校准的流动荧光信号。应在与转录反应相同的实验条件下进行校准。

结论

MDCC-SSB生物传感器是一种低成本、快速、易用和可靠的mRNA测量工具在体外转录化验。该工具不需要RNA纯化。此外,该生物传感器可用于定性和定量分析。有了这个工具,可以更快地识别转录成分,从而更好地理解转录的复杂性质。CLARIOstar协助MDCC-SSB的检测开发和可靠定量mRNA。


参考文献

1.Hahn, S.(2004)《自然结构与分子生物学》,11,394 -403。DOI: 10.1038 / nsmb763
2.Cook, A.等(2018)生化与生物物理研究通讯。DOI: 10.1016 / j。bbrc.2018.01.147
3.Dillingham, M. et al.(2008)。生物物理学报,33(2),391 - 397。DOI: 10.1529 / biophysj.108.133512

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