299

BMG实验室仪器上基于吸光度的蛋白质定量方法德赢vwin官网客服

安德里亚·克拉姆 德赢vwin官网客服 09/2016
  • 蛋白定量与BMG LABTECH仪器使用A德赢vwin官网客服280、Bradford-、BCA-和lowry -分析
  • 预定义的协议支持简单和快速的测量德赢Vwin安全吗
  • 使用火星分析软件的一次点击计算蛋白质浓度

表的内容

介绍

测定液体样品中的蛋白质浓度是许多生命科学实验室的常规分析方法。准确的定量通常是后续分析的关键步骤,如蛋白质表征或western blot。以吸光度为基础的方法是成熟的,容易操作和便宜。它们可以在微孔板中进行,允许一次处理的高样本数和低试剂量。基于光谱仪的BMG LABTECH阅读德赢vwin官网客服器可以在不到一秒的时间内捕获从220-1000 nm的离散波长的吸收光谱或吸光度,因此可以很容易地读取这些分析。本文介绍了最常用的280 nm吸光度法、Bradford法、Bicin-Choninic Acid (BCA)法和Lowry法。


材料与方法

  • 试剂从Sigma Aldrich获得
  • 清除96孔板从Greiner
  • SPECTROstar®纳米, FLUOstar®ω,PHERAstar®FSX和CLARIOstar®BMG LABTECH的平板阅读器具有德赢vwin官网客服快速和精确的默认设置
  • 将标准蛋白牛血清白蛋白(BSA)用ddH2O溶解到2mg /ml的液体中

结果与讨论

280nm处的吸光度
色氨酸和酪氨酸的芳香残基吸收波长为280nm的紫外光(图1A),反映了蛋白质的浓度。该方法不需要进一步添加试剂,是一种快速、简便的定量方法。使用低至3µl的体积和BMG LABTECH LVis平板,可以可靠地检测到125-1000µg/ml的BSA浓度范围(图1B)。德赢vwin官网客服

  • 3µl (ddH中的BSA2O)一式两份印在LVis印版上
  • 吸光度240-400 nm, A280

布拉德福德化验
Bradford实验利用了考马斯亮蓝G-250的吸光度从自由状态的460 nm转移到与蛋白质配合时的595 nm(图2A)。未知蛋白样品的吸光度与平行测量的特定蛋白(如BSA)浓度的样品有关。检测结果在62.5-1000µg/ml BSA范围内呈线性信号(图2B)。

  • 5µl sample + 250µl Bradford solution -> Shake for 30 s
  • 在黑暗中孵育5-45分钟->测量吸光度400-700 nm(在595 nm分析)

BCA测定法(双喹啉酸)
BCA测定是基于肽键将硫酸铜还原为铜的能力+这反过来与两个分子的BCA给予一个发色团在562 nm吸光度最大(图3A)。该方法还将未知蛋白样品的测定与已知蛋白浓度样品的校准曲线联系起来。使用双曲线拟合(图3B), BCA法可以定量广泛的BSA浓度范围,从15.63-1500µg/ml(图3B)。

  • 240µl工作试剂+ 30µl样品
  • 37°C孵育30分钟->测定吸光度450-750 nm (562 nm分析)

洛瑞分析
改良的Lowry试验同样依赖于肽键还原硫酸铜(II)。铜的后续反应+与Folin-Ciocalteu试剂的蛋白复合物产生的发色团具有500至800 nm的宽吸收光谱(图4A)。该定量分析需要平行测定校准曲线。使用改进的Lowry法和双曲线拟合(图4B),可以可靠地检测到15.63 ~ 1000µg/ml的BSA溶液。

  • 100µl样品+ 100µl Lowry试剂->孵育20分钟
  • 加入50µl福林和Ciocalteu的酚试剂并混合
  • 孵育30分钟->测量500-800 nm(分析在710 nm)

表1:蛋白质定量方法比较。

浓度范围(µg / ml) 15.63 31.25 62.5 125 250 500 1000 1500 分钟的时间。 体积 最小的蛋白质
每个反应(µg)
一个280 1 2 - 3µl 0.38
布拉德福德 5 5µl 0.31
BCA 30. 30µl 0.47
洛瑞 50 100µl 1.56

结论

标准的基于吸收的蛋白质定量分析很容易被BMG LABTECH reader检测。德赢vwin官网客服蛋白质定量方法在覆盖浓度范围、所需体积和制备和孵育时间方面有所不同(表1)。然而,适当的定量取决于其他因素,如缓冲液中的洗涤剂,它们不同地干扰测定。


参考文献

1.布拉德福德,M.M.(1976)肛门,生物化学。, 72248 - 254。
2.罗瑞等(1951)。化学。, 193, 265 - 275。
3.Smith PK. et al.(1985)肛门。, 150(1), 76 - 85。

去前