吸光度

吸光度是多少?

一般来说,吸光度是光与物质相互作用的过程。当光照射到吸收一些光的物体时我们讨论吸光度。当然,被吸收的光并没有丢失;当吸收的分子被激发时,它转化为热能或化学能。吸收是一个物理过程,我们每天都会遇到,因为我们看到颜色:白光,如阳光,包含所有颜色的可见光。当它照射在绿色的草地上,草地吸收了所有的颜色,但绿色。绿色的光被重新发出,这就是草的颜色。

为什么测量吸光度?

在生物学和化学中,吸光度原理是用来量化溶液中吸收分子的。许多生物分子自身吸收特定波长的光。核酸和蛋白质吸收紫外光,叶绿素吸收蓝色和橙色/红色的光,血红蛋白吸收黄绿色的光。这些分析物不需要进一步的处理就可以被定量,至少如果它们在低背景吸光度的溶液中被发现。然而,吸光度定量并不局限于少数吸收分子。化学反应有助于产生定量吸收分子。这些反应取决于特定的底物或酶。因此,在样品中发现的化合物/酶越多,显色(和吸光度)就越强烈。下面给出了许多测定吸光度的例子,从测定蛋白质浓度到测定细胞活力。

吸光度测量的理论背景

试管和微孔板中的检测路径

传统上,在比色皿中进行吸光度测量:将具有已知吸光度特性的分析物的溶液置于比色皿中。然后,吸光度读卡器通过通过样品发送具有已知强度的光并检测样品后面的强度来确定吸光度。没有使其通过探测器的光被吸收或分散。散射部分通过测量适当的坯料分开确定,并从该值中减去以获得感兴趣的物质的纯度吸光度。

吸光度测量的结果-透射率,吸光度和光密度

能够通过样品的光也叫透射,主要用百分数表示(图2)。溶液中被分析物越多,被其吸收的光越多,透射率越低。然而,吸光度是被分析物所吸收的光的一部分。它是传输数的对数(10的次方)的绝对值1。下面是数学方程式和一些数字来解释透射率和吸光度所描述的内容:

传输:T = I/我
吸光度:a = -log10T.

表1:传输和吸收值的例子

传输 吸光度
0.1(或10%) 1 od.
0.01(或1%) 2 OD
0.001(或0.1%) 3 OD

化学和生命科学中的吸光度。定量溶液中的物质

在进行吸光度测量后,结果是一个以透射率或光密度给出的值。然而,测量的目标是对溶液中的物质进行量化,明显的问题是如何将信号转化为浓度值。一般来说,有两种方法:利用比尔-朗伯定律或测量平行于未知浓度样品的标准曲线。


比尔-朗伯定律

比尔-朗伯定律描述了吸收物质的吸光度、路径长度和浓度之间的关系:


a = c * d *ε
c=A/(d*ε)


Beer-Lambert法律具有吸光度,C - 浓度,D - 路径长度,ε-消光系数。


它说吸光度与浓度乘以路径长度和消光系数成线性关系2。路径长度是指光必须经过的样品长度。例如,在试管中,路径被标准化为1厘米。消光系数是吸收物质和特定波长的常数,通常是该物质的吸光度最大值。它提供了特定物质吸收特定波长光的强度的信息。例如,牛血清白蛋白(BSA)的质量消光系数为0.67µl*cm1*μg.1。因此,1µg/µl BSA路径长度为1 cm时的吸光度为0.67 OD。


比尔-朗伯定律非常有用,因为它允许对吸收物质进行定量,而不需要添加任何其他试剂。然而,它有如下所述的局限性。


比尔-朗伯定律只有在

  • 分析物在特定波长下吸收光
  • 路径长度已知
  • 已知分析物的消光系数
  • 缓冲剂试剂的吸光度与分析物的吸光度不重叠

使用标准曲线

如果这些标准不适用,有可能间接测量分析物和/或使用标准曲线。例如,比色蛋白定量测定法,如布拉德福德测定法,依赖于一种增加蛋白质存在时吸光度的物质。在已知蛋白质浓度和样品浓度的标准曲线上测量增加,从而可以计算出它们的浓度。

如何检测吸光度?

光源

不言而喻:测量光的透射/吸收首先需要光。不同的光源可以用来测量吸光度。它们所覆盖的光谱范围、强度和发出的光的稳定性各不相同。


钨卤灯覆盖范围从360纳米到1000纳米以上,由于其成本效益经常使用。氙灯则覆盖了220nm到1000nm的光谱区域,覆盖了紫外光谱范围。这使得核酸(260nm)和蛋白质(280nm)的检测和定量成为可能。德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器配备了氙气闪光灯进行吸光度测量,因此提供了最大的灵活性来测量任何波长在220到1000 nm之间,或所有的整个波长的光谱。


样本

感兴趣的液体需要转移到比色皿或微孔板中以测量它们的吸光度。比色皿和微孔板的材料总是清楚的,以确保最大的透光,因为溶液的吸光度而不是材料对研究人员感兴趣。尽管如此,各种材料很常见,与一个不同的材料。多苯乙烯最常使用,并且可以改变以提供特异性结合特性,用于细胞培养物或ELISA应用。然而,它们在UV范围内是非透射的,其需要使用环状烯烃共聚物的特殊板来测量400nm以下的吸光度。


样本量

要考虑的第二个方面是可靠的吸光度测量所需要的样品体积。标准试管大约需要4.5 ml,而半微体积的试管可以将体积减少到1.5 ml,微体积的试管需要70µl。试管测量是水平的:光从一侧射入样品,在另一侧检测透射光。因此,试管的几何形状提供了1厘米的标准路径长度。这是与微孔板垂直测量(从上到下或从下到上)的主要区别之一。因此,路径长度也会随着样本体积的变化而变化,要求每次实验使用等体积。此外,在微孔板吸光度测量中,弯月效应对路径长度起着重要作用。当有强半月板时,在微孔中间进行测量的路径要比没有半月板时短得多。这在应用Beer-Lambert或在实验中使用高度变化的半月板时尤为重要。在水溶液中,利用水的吸光度(水峰路径长度校正)。

标准96孔板通常与样品体积相等,在100-300μL之间,如果2.9至7.4mm,则平移到近似的路径长度。可能需要进一步降低珍贵样品的体积而不会损害路径长度。为此,可以使用半区域板或更高密度板。它们提供较小的井区域,但与标准的96孔板相同,因此提供具有较低容量的高路径长度。


适当的空白

为了校正从缓冲液组分、平板和光散射效应产生的不需要的吸光度的测量值,将空白平行于样品进行测量。适当的空白包含除分析物外的所有成分。相反,这意味着PBS或水空白常常不够。


应特别注意分析的样品和空白中的粒子。颗粒散射光并增加测量的吸光度值,因为较少的光到达检测器。随着颗粒在溶液中移动,当它们阻挡光路时被检测到。当从检测路径移出时,将无法测量。这种现象增加了吸光度数据的可变性。如果不能从测量的溶液中取出颗粒,建议在吸光度测量中覆盖微孔板的更大面积,该特征是所有BMG LabTech器件的吸光度测量。德赢vwin官网客服

吸光度测量检测器

透射光通过样品后需要检测。两种不同类型的探测器通常用于微孔板阅读器:光电倍增管(PMT)或CCD光谱仪。基于PMT的系统在检测前需要选择波长。这是通过滤光器或单色器来完成的,在它被引导到样品之前,选择所需的波长。所需波长的透射光然后到达PMT。PMT放大来自透射光的信号,并产生指示其强度的电压。为了扫描波长范围内的吸光度,基于pm10的系统使用单色仪为光谱中的每个点选择所需的波长,然后依次测量它们。


这是与第二类吸光度探测器光谱仪的主要区别。它将透射的光分解成不同波长的光,这些光被定向到一个CCD探测器上,同时捕捉所有波长的光强。这样,光谱以及单个或少数波长的测量可以在相似的时间内获得。例如,BMG LABTECH德赢vwin官网客服 instruments公司UV / Vis光谱仪用于吸光度测量,捕获在少于一秒钟的整个光谱(220 1000nm)的情况下。

吸光度测量中的陷阱

使用错误的板材

在紫外范围内测量时,由于核酸或NADH需要,所以绝对需要使用紫外透明板。否则,吸光度测量将导致所有样品的吸光度达到最大值。

试管与微孔板测量的比较

在试管中,路径长度归一化为1厘米,但在微孔板中,路径长度随体积和板的格式而变化。因此,在微孔板中获得的吸光度通常低于在试管中测量的同一溶液的吸光度。如果测量的是水溶液,孔板测量可以归一化到1厘米,使用水峰路径长度校正。路径长度的测定进一步允许用啤酒兰伯特法律计算分析物浓度。

使用不同的卷

对于微孔板中的测量,建议始终使用相同的音量来为所有样本生成相同的路径长度。然而,在具有弯月面的样品中,尽管使用相同的体积,但是路径长度可能不同。再次,用于水溶液水峰路径长度校正可用于克服这一问题或确定路径长度的比尔-朗伯计算。


光路干扰

光程中的任何物质都会增加测量到的吸光度。通常这些是样品中的气泡、盖子上的冷凝、灰尘、板底部的划痕或指纹。因此,建议在测量前检查板。

吸光度通常用什么来衡量?


蛋白定量

许多吸光度测定的目的是测定溶液中蛋白质的浓度。有几种比色法可用于测量样品的全蛋白质含量。在下游应用如western blot或免疫沉淀前,这是必须的。在我们的博客文章中蛋白质测定:找到合适的方法你会找到Bradford, BCA和其他方法和提示的详细描述来帮助你选择。

elisa

使用吸光度,也可以在溶液中量化特定蛋白质。一种普遍的方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)。简而言之,固定在微孔板中的抗体良好地特异性地结合感兴趣的蛋白质并将其捕获在板中。同样特异于利益蛋白质的第二抗体与捕获的蛋白质结合,并且可以通过仲酶抗体识别。因此,在样品中存在的蛋白质较多,较多的酶将在微孔板中结合。由酶转化为发色团的基材最终通过吸光度和报告样品中存在的特定蛋白质的量来测量3.

细胞活力

ColoriCetric测定,报告细胞健康的报告是流行的,因为它们是快速和成本效益的欢迎。当采用微孔板时,可以立即测试许多条件。基于吸光度的方法主要依赖于代谢活性细胞的能力,以减少诸如MTT或raetazurin的底物。它们减少的形式在特定波长下显示吸光度,因此报告细胞样品的代谢活性,经常受细胞活力影响的特征4.。我们的细胞活力博客文章详细描述了测量细胞健康的比色和其他方法。

微生物生长

酶标仪和光度计的吸光度读取模式通过测量“600 nm的光密度”(OD)来确定细菌和酵母的增殖600)。有趣的是,在这个应用中,测量模式只是被“误用”来报告光散射5.。微生物悬浮液中的颗粒(细菌或酵母)散射光:溶液中存在更多的微生物,散射的光越多。这也意味着较少的光到达检测器,并且测量的变速器较低。以这种方式,计算较高的吸收对于增加的微生物数量,尽管这种变化是仅通过在光散射的增加而不是600nm处的特定吸光度来引起。

参考资料

1. Iupac,化学术语的纲要,第2版。(“金书”)(1997)。在线纠正版本:(2008)“吸光度”。DOI:10.1351 / goldbook.a00028


2.《化学术语汇编》,第2版(“黄金书”)(1997)。在线修正版:(2014)"比尔-兰伯特定律(或比尔-兰伯特-布格定律)"。doi: 10.1351 / goldbook.B00626


3.克洛泽,jr(1995)。第二章ELISA基本原理。ELISA:理论与实践。胡玛纳出版社。35 - 62页。ISBN 0896032795。


4. RISS,T. L.(2013)细胞活力测定。测定指导手册。Bethesda(MD):Eli Lilly&Company和国家推进翻译科学中心。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/

5.Keiran Stevenson等人(2016)微孔板阅读器中微生物生长的一般校准。科学报告第6卷,论文号:38828 (2016)https://doi.org/10.1038/srep38828

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