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使用PHERAstar进行激酶抑制剂HTS的ADP Hunter试验

林迪舞考夫曼。Uyen Hyugen DiscoverX公司 05/2006
  • 利用PHERAstar在荧光模式下筛选所有可能的蛋白激酶®FS
  • ADP的直接测量,因此成本效益:不需要特异性抗体或放射性珠
  • 简单、稳健的Z’> 0.7检测

表的内容

介绍

蛋白质激酶作为真核生物信号转导的媒介,控制着基因转录、细胞周期、迁移、凋亡和分化等多种细胞过程,被认为是药物发现的重要靶点。理想情况下,激酶HTS筛选需要在抑制剂药物发现过程中具有广泛适用性的激酶分析平台,因此,激酶靶点和底物一般都适用。大多数非放射性激酶试验格式在这方面受到限制,因为它们需要特异性抗体或亲和力捕获试剂来检测磷酸化底物的产生。通常磷酸化底物的特异性抗体是不可用的,而亲和力捕获方法有限制的激酶检测条件,可以使用。在底物磷酸化过程中,所有的激酶消耗ATP,并在激酶反应过程中测定ATP消耗。然而,这种方法受到激酶所需ATP浓度的限制,导致高检测背景。因此,小信号减少,如发生在弱活性激酶是很难检测。


一种最佳的方法是测量激酶反应的一般产物即ADP的积累。这种技术的结果是检测信号的增加直接与激酶活性成正比,并具有显著的优势,检测是在ATP浓度范围内进行的,包括在ATP K价值。因此,当评估ATP K时,新化合物的抑制能力,是ATP结合位点活性的可靠测量方法,很容易与其他激酶的类似测量方法进行比较。此外,ADP积累的测量允许激酶底物选择的灵活性,因此肽和内源性底物(包括在自磷酸化期间)激酶都可能被利用。

DiscoverX开发了一种基于均质荧光的检测方法来测量ADP的产生,ADP是激酶活性的通用产物。测定使用酶偶联反应产生红移荧光信号,该信号与溶液中ADP的量成正比。ADP Hunter是一种生化检测方法,用于测量ADP的积累(图1),ADP是激酶酶活性的通用产物。


ADP Hunter是专门为高通量筛选激酶抑制剂。该检测被设计用于全体积384孔微孔板,但也可以在其他微孔板格式中运行。为了实现自动化,还提供了一个停止解决方案,以增加信号和背景稳定。与监测激酶反应中ATP消耗的其他通用方法不同,该方法跟踪反应的产物,并提供了一种方便的信号获取分析格式。本应用笔记描述了在BMG实验室的pherstar上测量的ADP Hunter检测方法的使用德赢vwin官网客服FS多模标

材料与方法

德赢vwin官网客服BMG LABTECH的PHERAstarFS结合高温超导所需的快速极板读数与读取小流体体积所需的增强性能和灵敏度。


的PHERAstarFS可读取所有领先的高温超导探测模式,如荧光强度、时间分辨荧光、荧光偏振、发光和吸收等,格式可达1536。的PHERAstarFS以荧光模式运行,用于监测ADP Hunter演示试剂盒(DiscoverX公司),其中包含以下试剂:


表1:ADP Hunter演示套件组件

设备组件
1 ADP Hunter试剂 8毫升
2 ADP Hunter试剂 15毫升
3. ADP Hunter停止解决方案 4毫升
4 ADP Hunter标准(360 μM) 2毫升
5 ADP Hunter检测缓冲液 20毫升

根据包插入方案(表2),在黑色壁384孔板(无粘结聚丙烯板;他一一)。


表2:标准曲线的ADP Hunter协议

384孔板满卷 ADP标准
步骤1:标准稀释 ADP标准品稀释8 μL
步骤2:ADP检测 a)加入8 μL试剂a
b)加入16 μL试剂b
c)孵育60分钟
第三步:停止解决方案 加入4 μL停止液
读出荧光强度信号:
雷乌芬激发波长:530-10 nm
再苯二酚发射波长:590-20 nm
注:信号可在2小时后测量
停止液的添加

在pherstar上加入最后一种试剂1小时后,读出荧光信号(例如:530-10 nm/Em: 590-20)FS使用以下协议进行读卡器设置(图2)。

结果与讨论

DiscoverX ADP Hunter检测方法采用384口井的格式,标准曲线在BMG LABTECH的pherstar上运行德赢vwin官网客服FS在荧光模式。按照测定方案加入ADP标准检测试剂,在最后一种试剂加入1小时后读出荧光信号。ADP标准曲线如图(图3)所示。

ADP Hunter检测格式被设计成产生与ADP生成量成正比的正信号。动态测定范围为1.5 ~ 120 μM ADP。简单的均匀分析格式,提供可靠的和可重复的结果,信号与背景比>10和典型的Z '值>0.7。ADP Hunter基于产生正红移荧光信号的酶偶反应,最大限度地减少荧光化合物的干扰。此外,ADP Hunter集成了一个停止解决方案,在批处理模式下稳定筛选板的检测信号。在这里,我们描述了在PHERAstar上分析通用激酶筛选试验的价值FS乐器。他们一起为激酶筛选需求提供了一个强大的解决方案。


结论

对于那些无法接触到修饰底物、磷酸化状态特异性抗体或无法或不希望使用放射性的客vwin088户来说,这种检测方法是一种有用的工具。这些试剂的设计是强大的,适用于高通量流体分配系统使用简单的平板阅读器。的PHERAstarFS其创新和用户友好,直观的软件允许最大的灵活性和易用性。


有关DiscoverX化验的更多信息,请参阅网站:www.discoverx.com


ADP Hunter, DiscoverX和DiscoverX标志是DiscoverX公司的注册商标。

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