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AlphaScreen Surefire磷酸-ERK1 / 2测定

JD Brown R. mold CJ Langmead 铰接疗法治疗 01/2011
  • ERK磷酸化级联可用于测量GI和GQ GPCR
  • 的AlphaScreen®Surefire.®磷酸-ERK1 / 2测定以384孔格式进行
  • 显示了Gi和Gq激动剂的剂量响应曲线

介绍

G-蛋白偶联受体(GPCR)是一种大型受体,具有宽泛参与影响健康和疾病的许多重要身体功能的细胞反应。在激活GPCR中通过不同的G-蛋白(例如GS,GI或GQ)来引发能够通过激活包括细胞内Ca的不同信号级联来介导的细胞响应2 +动员和腺苷酸环化酶的形成或抑制:尽管这些技术在许多情况下都是成功的,但它们也有其局限性。许多GPCRs的响应,如Gi耦合的GPCRs,在目前的分析格式中很难测量,其他方法已经被研究作为替代读出。其中一种途径是ERK磷酸化级联反应,它可导致调节基因转录的细胞质和核蛋白的磷酸化。因此,这种类型的检测有能力测量由Gs、Gi和f Gq耦合受体激活的细胞变化,从而有可能使用单一的检测格式进行筛选。


在这里,装有闪光灯的微孔板阅读器使用AlphaScreen检测ERK磷酸化®Surefire.®是附近化验。ERK磷酸化在受体上被证实,信号通过Gi和Gq g蛋白。

测定原则

的AlphaScreen®实验使用单态氧从供体到受体珠的扩散。供体微珠在680 nm激发后,以每秒60000个分子的速度将周围的氧转化为单态氧。单态氧分子寿命短(水溶液中为4 μs),扩散不超过200 nm。当生物分子相互作用使供体珠和受体珠接近时,单态氧到达受体珠后,一连串的化学反应被触发,在520-620 nm范围内产生放大的发光信号。的AlphaScreen®Surefire.®ERK1/2磷酸化检测是基于免疫三明治检测原理(图1)。


磷酸化的细胞蛋白(分析物)夹在与分析物抗体相关的链霉抗生物素蛋白(SA)涂覆的供体珠之间,与与抗磷特异性抗体相关的蛋白质A缀合的受体珠。分析物的磷酸化导致发光信号的增加。

材料与方法

  • 来自BMG实验室的Microplate阅读器配德赢vwin官网客服备了AlphaScreen®选项
  • alphascreen.®Surefire.®ERK1/2磷酸化检测试剂盒
  • alphascreen.®蛋白质是一般IgG检测试剂盒,PerkinElmer
  • Proxiplate™-384加,白色,384浅孔板,PerkinElmer
  • 96孔半区域组织处理的细胞培养板,康宁

将稳定表达Gq或Gi偶联GPCR的CHO细胞,以25K /孔的细胞密度在96孔半面积的组织培养处理板中培养,37℃让细胞粘附4h。4h后取出培养液,用45 μL DMEM/F12 w/o FBS代替,使细胞静息。细胞孵育18h后进行实验。在时间过程实验中,添加5 μL,在浓度响应曲线实验中保持不变,5 min,改变孵育时间。孵育期结束后,取出培养基,用裂解缓冲液裂解细胞。然后将裂解液转移到白色的384浅孔Proxiplate™和AlphaScreen中®根据试剂盒方案在单个移液步骤中加入珠子。将板孵育2小时并读入微孔板读数器。数据表达为用0.3%FB获得的最大响应%。

仪器的设置

测量方法: alphascreen.
阅读模式: 端点
过滤器: 交货/ Em

一般设置

激发时间: 0.30秒
集成开始: 0.34秒
积分时间: 0.60秒

成绩与讨论

初步实验旨在查看两个受体的刺激时间。

激动剂刺激使pERK1/2短暂升高,在5分钟时Gi和Gq受体激活达到峰值。使用5分钟的刺激时间点,标准激动剂以浓度响应曲线的形式呈现(图3A和B)。

的AlphaScreen®Surefire.®ERK1/2磷酸化检测系统能够检测g蛋白偶联受体信号,并可以使用BMG LABTECH微孔板阅读器进行可靠的测量。德赢vwin官网客服


结论

的AlphaScreen®Surefire.®ERK1/2磷酸化试验成功地以384孔格式进行。

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