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使用Oris cell migration assay TriCoated kit进行迁移分析

iman van den bout 帕特森曼彻斯特癌症研究所研究所 11/2009
  • 敲除U2OS细胞用于鸭嘴兽®奥里斯TM值细胞迁移系统检测细胞迁移所需的磷酸钠代谢是否
  • 使用CO实时监测细胞迁移2气体排气系统

介绍

整联蛋白的蛋白质对于细胞粘附的能力并迁移到细胞外基质组分是必不可少的。在家庭中有两个独特的整体整合素,可以通过它们与含有细胞外基质组分的RGD的能力鉴定,例如纤维连接蛋白和作为胶原受体的那些。上皮细胞片的迁移可以在发育或伤口愈合期间发挥重要作用。磷酸钠,如ptdins3,4,5 p3和ptdins4,5P2.被认为在移民过程中起着重要作用。为了研究细胞系中的迁移,通常进行划痕分析,即划痕一个融合的单层以去除一条细胞带,然后定量细胞从边缘到间隙的移动。这种方法有几个缺点,包括去除ECM组件和破裂的细胞都可能扭曲的结果。


的口的TM值细胞迁移测定特异性特异性试剂盒具有与传统迁移测定相比的某些优点,包括测试不同ECM组分对迁移时不同ECM组分的效果的能力。使用siRNA和orisTM值三酸细胞迁移实验表明,磷脂酰肌醇对迁移很重要。我们能够使用配备CO的BMG LABTECH微孔板阅读器实时测量不同ECM组件上的迁移德赢vwin官网客服2传送系统使细胞在读卡器中保存48小时成为可能。

技术概述

的口的TM值细胞迁移测定设计为独特的智思TM值细胞播种塞,检测掩模和去除工具。简单地播种每个孔中的细胞,允许它们粘附,拆下塞子以创建检测区,并测量迁移。的口的TM值细胞迁移测定 - 三个表面提供三个表面(32孔ACH的组织培养物处理,胶原I和纤连蛋白)在单个96孔微孔板上。普拉巴斯网站上可以找到更多详细信息:www.platypustech.com/discoverassay.html

材料与方法

  • DII-C16(分子探针®,Invitrogen)
  • 核(Dharmacon)
  • 奥里斯TM值细胞迁移测定(Platypus Technologies,LLC)
  • Microplate阅读器(BMG L德赢vwin官网客服ABTECH)

在用Fcs,PEN / STREP和来自Invitrogen的Sigma获得的DMEM中生长细胞。从Gibco获得酚红DMEM。在这些测定中使用骨肉瘤细胞系U2OS。

迁移试验
将U2OS细胞以100000个细胞/孔中接种在6个孔板中,并通过每孔10μl20μmsiRNA与3μldharmafect转染第二天。阴性对照siRNA也分别转染。过夜孵育后,细胞被胰蛋白酶化,洗涤并计数。将每个测定所需的细胞总量悬浮在含有2.5μmIII的1ml酚红培养基中,将细胞在37℃下孵育30分钟。然后,将细胞离心并重新悬浮在酚红培养基中至300000个细胞/ ml的浓度。凝胶载荷提示用于将100μl含有100μl的奥利斯孔中的所有悬浮液TM值细胞迁移试验。在每种条件下,以不加细胞插播器的井作为阳性对照。然后培养皿在37°C孵育过夜。第二天,从试验井中取出细胞播撒塞,将培养基弹开。每孔加200 μL无酚红培养基。检测掩模附着于板的底部,将板置于预热过的板读卡器中。


在所有实验中,荧光在544 nm激发和590nm发射。在48小时的时间里,每隔20分钟使用底部光学仪器进行读数。增益调整为阳性对照的70%。

完成试验后,使用BMG LabTech提供的MARS数据分析软件进行分析数据。德赢vwin官网客服首先,使用来自第6个DataPoints的数据对原始数据执行基线校正。接下来,使用在三个数据点上的移动平均来平均曲线。


成绩与讨论

用对照非靶向siRNA或用靶向特异性蛋白质(A,B,C)的三种不同的siRNA池转染U2OS细胞。用于组织培养(TC)处理的信号曲线,胶原I和纤连蛋白涂覆孔如图2,3和4所示。

在动力学计算窗口中使用求和函数来确定每个样品曲线下的面积。求和值取平均值,计算总体标准差(图5)。

数据表明,转染对照siRNA的U2OS细胞在I型胶原上迁移最快,而在纤连蛋白和tc处理的孔中迁移都有所减少。与对照组相比,转染siRNA池A的细胞在tc处理的孔上迁移下降了34%,而I型胶原下降了41%,纤维连接蛋白下降了45%。转染siRNA B池的细胞在所有测试表面的迁移到siRNA a池的过程中都出现了类似的下降。与对照组相比,siRNA池C的敲除作用更为显著,tc处理的孔迁移率下降了75%,I型胶原下降了53%,纤维连接蛋白表面下降了69%。从这一数据可以清楚地看出,C siRNA结构在很大程度上抑制了tc处理孔和纤维连接蛋白上的细胞迁移,而在细胞中对I型胶原的影响较小。


结论

该测定结果表明,基因A,B或C的敲低对细胞迁移有影响。迁移受到组织培养物,纤连蛋白和胶原I表面的抑制,表明这些基因的效果不是整合蛋白特异性。由于所有三种撞击在这些细胞中的蛋白质涉及磷酸膦酸性代谢,我们可以得出结论,磷酸阳性对细胞迁移具有重要性。

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