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用HTRF分析绑定动力学

尼古拉·皮埃尔·托马斯·鲁 Cisbio Bioassays, Codolet,法国 05/2019
  • PHERAstar microplate阅读器提供了高时间分辨率的动力学trfret测量
  • 非放射性和高通量方法测定结合动力学

介绍

药物的特征是其平衡常数KD它描述了化合物对其目标物的亲和力。它是指饱和结合时配体浓度的一半。然而,这个解离常数只适用于平衡态,忽略了缔合和解离速度的重要性。药物的最佳动力学结合与所关注的靶点和相关疾病不同。一方面,缓慢的解离常数有助于增加药物作用时间(例如噻托溴铵用于COPD治疗- Disse等人)。生命科学,1999)。另一方面,有假设认为,对于特定的目标,快速解离可以减少目标的副作用(Kapur & Seeman,精神病学神经科学J, 2000)。在这里,我们提出了测定螺哌酮-d2结合多巴胺受体D的结合和离解速率2(D2R),G蛋白偶联受体(GPCR)和抗精神病药物的靶标。

测定原则

使用具有铽密加密的受体和D2-鲁莫罗尔标记的斯波酮的细胞监测Spiperone-D2至D2R的结合。

隐铽是一种寿命很长的荧光团,作为供体。在配体与受体结合的情况下,它将能量传递给与螺旋素相关的d2。因此,配体与受体的相互作用可以用受体与供体发射信号的比值来描述。

材料与方法

  • Tag-lite多巴胺D2标签细胞(Cisbio Bioassays, #C1TT1D2)
  • Spiperone-d2 (Cisbio bioassay, #L0002RED)
  • 标签-lite标记介质(Cisbio Bioassays, #LABMED)
  • 384井板(小体积,Greiner#784075)

实验的程序
反应按照Cisbio配体结合协议说明进行。简单地说,在总反应体积为20µl的条件下,用不同浓度的d2标记的配体Spiperone孵育3.700个供体标记的细胞。使用下面列出的仪器设置,pherstar可以实时监控绑定。

仪器的设置

光学设置 时间分辨荧光,平板模式动力学,同时双发射
光学模块: HTRF
通用设置 闪光次数: 40
解决时间: 0
集成开始: 60µ年代
积分时间: 400μs.
动力学设置 周期: 61.
周期: 60年代
孵化 没有

成绩与讨论

a)确定k和k在pherstar上进行了联想实验

k配体结合的动力学测量/ k的决心
配体与其受体的结合不是静态的,而是通过配体结合的速率和通过使其相互作用伴侣的速率的速率进行定义。这些动态由速率描述(k,有多少个配体分子在一分钟内结合受体),并通过非速率(k,配体受体对的哪一部分在一分钟内解离)。为了确定两个速率,将配体Spipherone-D2加入到受体表达细胞中,并立即开始监测HTRF信号(图2)。

根据结合测量,计算每个配体浓度(t1/2协会)。根据以下关系,计算观察到的关联率(k奥林匹克广播服务公司)。另外,k奥林匹克广播服务公司可以直接用GraphPad Prism BioAnalysis软件的“单相结合”方程来计算。

表1:观测关联k的计算奥林匹克广播服务公司

Spiperone-D2(NM) One hundred. 50. 25 12.5 6.25 3.12 1.55 0
t1/2协会 2.11 3.34 5.56 8.83 11.02 15.4 19.35 0.273
K奥林匹克广播服务公司(最低1) 0.33 0.21 0.12 0.08 0.06 0.05 0.04 2.54

由于斯波酮红色到D2R受体的结合遵循了大规模作用模型的简单法,K奥林匹克广播服务公司应该与标记的配体浓度线性增加(Hill, J Physiol, 1909),然后观察到的关联率k奥林匹克广播服务公司定义为以下线性方程:

观察到的关联速率k奥林匹克广播服务公司随配体的增加呈线性增加,而缔合速率(k)和解离速率(k)是常数。绘制对k的配体浓度奥林匹克广播服务公司允许确定k和k速率(图3)。数据均为直线,表明约束遵循质量作用规律,模型可应用。

坚定的K.和k时,平衡常数计算如下:

表2:结合实验确定的结合动力学

k 0.0354 min.1
k 0.00346纳米1*闵1
KD 10.23纳米

比较-经典KD均衡确定

平衡常数KD描述达到最大配体-受体结合一半的配体浓度。它通常是通过在结合平衡时测量配体的结合来确定的。为此,在D中加入不同浓度的荧光基团标记配体螺哌酮-d22受体表达细胞。在平衡时(配体加入后60分钟)记录HTRF信号(图4),计算达到最大值一半的Spiperone-d2浓度为KD= 8nm(1hour)(图4)。

b)确定k通过测量pherstar上的解离度,计算出k

k离解的动力学测量的决心

为了测量荧光基团标记的配体螺哌酮-d2的解离,首先将其与受体在不同浓度下孵育,使其结合。然后,通过引入过量的未标记多巴胺受体激动剂(溴隐肽)来启动解离。通过测量PHERAstar微孔板阅读器上的HTRF信号来监测配体-受体相互作用的离解(图5)。

观察到的HTRF比率的下降源于供体荧光团与受体荧光团的分离,这妨碍了能量转移,并且表明了spiper1 -d2配体与D2R受体的解离。

解离速率k由本实验得出的公式为:

为了计算关联率k, K的测定D在稳定的状态实验中是必需的。为此,将不同浓度的Spiperone-D2与D2R表达细胞一起温育(图6)。半最大绑定(kD)测定为8 nM。计算k(= k/ KD)因此是8.75*104纳米1最小值1(表1)。

表3:spiroone -d2的解离药代动力学值

t1/2解离 99分钟
k 0.007 * min.1
KD 8nm.
k= k/ KD 0.000875纳米1最小值1

表3总结了Spiperone-d2解离实验得到的值。K是直接从解离实验和KD稳态实验中k计算。

关联率k的替代确定

另一种计算k的方法rate结合了分离实验的数据和关联实验的数据(参见a章的完整描述)。这个计算是基于实际的绑定是绑定和释放速度的总和。在遵循质量作用定律的情况下(Hill, J Physiol, 1909), k描述此假设如下:

这样产生的关联率是0.0032 nM1最小值1

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结论

在这里,Pherastar酶标读卡器与Cisbio的标签Lite相结合®测定技术测量斯波酮-D2与细胞多巴胺D结合的动力学2受体。


均匀的Tag-lite绑定技术与pherstar的速度相结合,提供了高时间分辨率,这是监控绑定动态和随后计算开/关速率所绝对需要的。

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