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Amplifuor SNPS基因分型系统使用BMG Labtech微孔板读卡器德赢vwin官网客服

一个汉密尔顿r梁b岁 澳大利亚国立大学的生物科学基因分型和映射划分 03/2010
  • 用放大器轻易检测到SNPS®来自Millipore的系统
  • 显示了详细的协议和仪器设置为此测定
  • BMG 德赢vwin官网客服Labtech微孔板读卡器已被证明是该测定的优秀读者

介绍

SNPS(单核苷酸多态性)是基因组DNA中的位置,具有物种的个体之间的单核苷酸差异。SNP是DNA序列中最常见的突变。这些小的遗传变异可以在基因组的编码和非编码区域中发生,并且可以对特定生物具有极端或没有影响。因此,SNP及其检测对于医学研究和药理学很重要。


通过多种不同的方法可以实现SNPS(SNP基因分型)的检测。在本申请中,我们描述了基于PCR的均匀荧光测定。放大器®毫可的SNPS HT基因分型系统用于借助BMG Labtech微孔板读卡器筛选多个样品。德赢vwin官网客服

测定原则

该方法利用两个荧光标记的寡核苷酸,该寡核苷酸由特异性的3'底漆序列区和5'发夹区域组成,所述5'发夹区域用两种荧光团(FAM或JOE)中的任一种标记。


3'引物序列的存在使这些荧光寡核苷酸能够与靶特异性未标记的引物一起使用,该靶特异性未标记的引物设计为研究人员的特定靶序列。因此,该方法可用于碱基的任何变型。(图。1)

研究人员简单地设计了包含5'尾巴的等位基因特异性引物,与荧光标记的引物上的3'尾巴匹配。在图1所示的示例中,如图1所示,FAM标记的引物是G-PREATED,而joe标记的引物是特异性的。通过寡核苷酸的5'发夹区域保持猝灭剂染料(dabsyl)在每种荧光团的紧密接近。在成功掺入引物之后,打开发夹区域,并且丁蛋白失去其淬火荧光团的能力,导致荧光信号大。在每个PCR循环期间产生的荧光直接相关与扩增的DNA的量相关。

材料与方法

  • 放大器®SNPS基因分型系统
  • Millipore铂金®Taq DNA聚合酶
  • Invitrogen Abgene 1100热速®PCR板,Thermo Scientific
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器

放大反应(除聚合酶外)所需的所有试剂应从-20°C储存中解冻。已经在蒸馏水或TRIS缓冲液(但不是TRIS-EDTA缓冲液)中稀释的DNA(5-150ng /μl)置于单独的齿条中。在制备扩增混合物之前,所有试剂均匀地混合并涡旋。试剂的鸡尾酒在无菌1.5mL微量离心管中在室温下制备。所有试剂以表1所示的顺序加入。试剂应在分配之前与移液管混合。

表1:扩增鸡尾酒制剂:反应体积-10μL。

试剂 1 rxn [μl]
DH2O 3.15-4.15
dntps(每个2.5 mm) 0.8
20x放大器SNP FAM引物 0.5
20x放大器SNP JOE引物 0.5
20x SNP特异性底漆混合物 1-2
10x反应混合物S加 1.0
铂金Taq(5u /μl)在最后一分钟加入 0.05
全部的 8.0

然后将DNA样品(2μL10L反应混合物)转移到PCR板中。对于突变的放大器;使用突变体,野生型,杂合子和NO DNA对照。然后将聚合酶加入扩增鸡尾酒,混合并纺下来。将8μL扩增的混合物添加到每个DNA样品/对照中。将板用光学透明的条密封,然后将其放入热循环液中并开始PCR程序。


对于一些测定,仅5μl的总反应体积也将工作。然而,需要相应地调整单个试剂的体积。

PCR计划
1. 95°C 4分钟
2. 95°C 10秒
3. 60°C 20秒
4. 72°C 40秒
5.转到步骤2循环34次
6. 72°C 3分钟
7. 10°C保持

完成PCR程序后,将板冷却至室温。板可以读取4°C或旋转,并放入BMG Labtech微孔板读取器中以进行读数。德赢vwin官网客服仪器以底部读取模式设置为读取FAM(激发490-10和发射520-10nm)和joe(激励530-10和发射560-10nm)。


德赢vwin官网客服BMG LabTech Reader设置

测量模式: 荧光强度
阅读模式: 端点/ flymode.
每孔闪光数量: 3.
视镜设置: 多元化;底部读数

不。 励磁 排放
1 490-10 520-10
2 530-10 560-10

NB:对于Omega读者,您需要使用3个垫片,用于Abgene 1100 PCR板。


成绩与讨论

测量后,数据被转移到可在Millipore主页下载的Excel宏。典型结果如图2所示。

结论

高S / B值表明BMG Labtech酶标仪是用于运行该测定的优异德赢vwin官网客服仪器。通过高精度和高吞吐量,易于测量来自Amplifuor SNP基因分型测定试剂盒(Millipore)的输出。

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