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活血吸虫被膜必需酶活性测定方法的建立

Madhu Sundaraneedi(1)Luke Becker(2)Giovanni Abbenante(3)Alex Loukas(2)Grant Collins(1)Mark Pearson(2) (1)澳大利亚新南威尔士大学物理、环境和数学科学学院(2)澳大利亚詹姆斯库克大学澳大利亚热带健康与医学研究所(3)澳大利亚BMG实验室德赢vwin官网客服 12/2017
  • 基于吸光度的测定评估不可缺少的血吸虫酶活性
  • 新药和疫苗的有效性可以在活寄生虫和实时测量
  • BMG LABTECH基于吸光度的微孔板阅读器在终点和动力学模式下可靠地读取分德赢vwin官网客服析结果

表的内容

介绍

血吸虫病是一种寄生虫病,影响着热带和发展中国家的2亿多人,每年造成严重发病率和30多万人死亡。血吸虫病只用一种药物治疗,没有疫苗。


控制血吸虫寄生虫的新药和疫苗可以通过针对对机体功能至关重要的机制来开发,并有必要导致寄生虫受损,最好是导致寄生虫死亡。血吸虫具有一种动态的外表面膜,称为被膜,它介导寄生虫的许多基本生物过程,如营养获取和免疫。因此,与被膜相关的分子在过去几十年中一直是血吸虫病药物和疫苗开发的重点。


在本申请说明中,我们选择了三种血吸虫表面相关酶,其寄生存活是必不可少的:碱性磷酸酶1;phospho-diesterase SmNPP-52和乙酰胆碱酯酶3.。这些分子在活的和完整的幼虫和成虫表面的活性可以使用培养的寄生虫实时测定,为评估针对这些酶的药物或疫苗的效果提供了工具。


测定原理

磷酸二酯酶smNPP-5、碱性磷酸酶和乙酰胆碱酯酶是血吸虫生存所必需的酶。活性酶将模型底物裂解成发色团(图1)。测定发色团的吸光度以报告酶活性。

材料与方法

测定组件

底物 测定缓冲器
磷酸二酯酶 胸腺嘧啶5 ' -一磷酸对硝基苯基酯(0.5 mM)

50 mM Tris-HCl,
120毫米氯化钠,
5毫米氯化钾,

60毫米葡萄糖,

ph 8.9

碱性磷酸酶 4-硝基苯基磷酸(2mm) 0.1甘氨酸,
1毫米MgCl2,
1 mm zncl2,
pH值10.4
乙酰胆碱酯酶 乙酰硫代胆碱(1 mM) 5,5′-二硫代(2-硝基苯甲酸)0.5 mM

0.1 M磷酸盐缓冲液,

pH 7.4

寄生虫在48孔板中孵育于0.5mL酶特异性检测缓冲液中(表1)。用不同数量的活幼虫(血吸虫)(每孔100、200、500、1000和2000)和成虫(每孔1、2、5和10对)重复进行测定,以估计稳定和可重复的结果所需的寄生虫数量。用荧光欧米茄测定吸光度®和下面的设置。


仪器的设置

FLUOstarω
视镜设置 吸光度,平板模式动力学
波长设置405 nm
通用设置 闪光数20
稳定时间0.5 s
动态设置 周期数68
循环时间900秒
孵化 37℃


结果与讨论

在图2中描绘了现场成人蠕虫中的乙酰胆碱酯酶活性的动力学数据。2(重复进行)。基板处理的速率随着蠕虫数而增加,所有基板都在2小时内加工10对蠕虫。

乙酰胆碱酯酶活性1小时的吸光度值下图(图3)表明酶活性和蠕虫数之间的线性关系。这表明每个活虫在其tegument中具有类似的乙酰胆碱酯酶的浓度。在成人蠕虫中获得碱性磷酸酶和磷酸二酯酶活性的类似结果(数据未显示)。

在三种酶的底物作用下,活的血吸虫也呈线性关系。17小时时磷酸二酯酶的吸光度值(图4A)和4小时时碱性磷酸酶的吸光度值(图4B)也显示底物处理速率和somule数量之间的线性关系(乙酰胆碱酯酶的数据未显示)。

结论

本研究证实,成虫和未成熟幼虫可用于实时测定寄生虫被膜中的三种关键酶。这项工作将对血吸虫病新药的筛选和开发有很大的帮助。这项工作还突出了fluosstar Omega酶标读卡器(BMG LABTECH)在这些检测方法开发和药物开发中的多功能性。德赢vwin官网客服除了荧光和发光能力,荧星欧米茄配备了一个强大的吸光度光谱仪,允许快速和可靠的终点和动力学吸光度数据。


参考文献

1.Sulbaran等(2013)Plos, Negl Trop Dis。
2.Bhardwaj等(2011)感染免疫。
3.Arnon et al. (1987) Mem Inst Oswaldo Cruz

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