315.

测定生物血吸虫皮下的基本酶活性的发展

Madhu Sundaraneedi(1)Luke Becker(2)Giovanni Abbenante(3)Alex Loukas(2)Grant Collins(1)Mark Pearson(2) (1)澳大利亚新南威尔士大学的物理,环境和数学科学学院(2)澳大利亚热带健康研究所,澳大利亚詹姆斯库克大学(3)BMG Labtech澳大利亚德赢vwin官网客服 12/2017
  • 基于吸光度的测定评估不可缺少的血吸虫酶活性
  • 新药和疫苗的有效性可以在活寄生虫和实时测量
  • BMG Labtech基于吸光度的微孔板读卡器可靠地阅读端点和动力学模式下的测德赢vwin官网客服定

介绍

血吸虫病是一种寄生疾病,影响热带,发展中国家有超过2亿人,每年引起严重的发病率和超过300,000人死亡。血吸虫病用单一药物治疗,没有疫苗。


通过针对生物体的功能至关重要的机制,可以通过对生物体的运作至关重要的机制来制定新的药物和疫苗,并且理想地导致血液损伤或优选地死亡。血吸虫具有称为Tegument的动态外表面膜,介导许多寄生虫的基本生物过程,例如营养率和免疫。因此,与Tegument相关的分子在过去几十年中一直是血吸虫病药物和疫苗发展的重点。


在本申请说明中,我们选择了三种血吸虫表面相关酶,其寄生存活是必不可少的:碱性磷酸酶1;磷酸二磷酸酯酶SMNPP-52和乙酰胆碱酯酶3.。使用培养的寄生虫可以实时测定这些分子对活性和完整的幼虫和成人血吸虫的活性,提供一种工具,以评估靶向这些酶的药物或疫苗的EF。


测定原则

酶磷酸二酯酶SmNPP-5,碱性磷酸酶和乙酰胆碱酯酶对血吸虫瘤的存在是必不可少的。活性酶切割模型底物到发色团(图1)。测量发色团的吸光度以报告酶活性。

材料与方法

测定组件

基质 测定缓冲器
磷酸二酯酶 胸苷5'-单磷酸二磷酸p-硝基苯基酯(0.5mm)

50 mm tris-hcl,
120 mm NaCl,
5毫米KCL,

60mm葡萄糖,

PH 8.9

碱性磷酸酶 磷酸4-硝基苯基(2毫米) 0.1米甘氨酸,
1 mm mgcl2,
1 mm zncl2,
ph 10.4
乙酰胆碱酯酶 乙酰硫代胆碱(1mM)5,5'-二硫双石(2-硝基苯甲酸)0.5mm

0.1米的磷酸盐缓冲液,

pH 7.4

将寄生虫在48孔板中以0.5ml酶 - 特定测定缓冲液(表1)温育。用各种数量的活幼虫(Schistosomula)(100,200,500,1000和2000,每孔100,500,000和2000)重复进行测定)和成人蠕虫(每孔1,2,5和10对),以估计所需的寄生虫数量适用于稳健和可重复的结果。用Fluostar Omega测量吸光度®和以下设置。


仪器设置

Fluostar omega.
视镜设置 吸光度,板模式动力学
波长设置405 nm
常规设置 闪光数20
建立时间0.5秒
动力学设置 周期数68
循环时间900秒
孵化 37℃


成绩与讨论

在图2中描绘了现场成人蠕虫中的乙酰胆碱酯酶活性的动力学数据。2(重复进行)。基板处理的速率随着蠕虫数而增加,所有基板都在2小时内加工10对蠕虫。

乙酰胆碱酯酶活性1小时的吸光度值下图(图3)表明酶活性和蠕虫数之间的线性关系。这表明每个活虫在其tegument中具有类似的乙酰胆碱酯酶的浓度。在成人蠕虫中获得碱性磷酸酶和磷酸二酯酶活性的类似结果(数据未显示)。

当它们与三种酶的底物一起温育时,还获得了LiNe Schistosomula的线性关系。对于磷酸二酯酶(图4A)和碱性磷酸酶(图4B)在4小时内,吸光度值(图4B)也显示出衬底处理速率和肢体数量的线性关系(未示出的乙酰胆碱酯酶的数据)。

结论

该工作确定成年血吸虫和未成熟的幼虫可以在寄生虫的Tegument中的三个关键酶的实时测定中使用。这项工作将极大地帮助筛查和开发新药治疗血吸虫病。该工作还突出了Flyostar Omega微孔板读取器(BMG Labtech)的多功能性,用于开发这些测定和药物开发。德赢vwin官网客服除了Floresce和发光能力外,FlyoStar Omega还配备了坚固的吸光光度光谱仪,允许快速可靠的端点和动力学吸光度数据。


参考

苏巴兰等人。(2013)Plos,Deptrop Tep。
2. Bhardwaj等人。(2011)感染Immun。
3. Arnon等人。(1987)MEM INSTWALDO CRUZ

去顶级