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使用Cisbio的HTRF表观遗传分析和BMG LABTECH的PHERAstar FS评估表观遗传酶活性德赢vwin官网客服

Thomas Roux (1) Rebecca LaRose (1) Carl Peters (2) (1) Cisbio (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 05/2014
  • HTRF测定检测组蛋白甲基转移酶G9A活性可用于筛选384孔格式的抑制剂
  • PHERAstar®FS一个flash fly模式提高了读取时间,从而提高了吞吐量

介绍

表观遗传学是一种新兴的科学舞台,其中基因活性和表达调节的变化不依赖于基因的序列。相反,表达的变化是DNA甲基化的结果或组蛋白的修正阳离子。这些修改对于正常发育过程至关重要,并且当表观遗传过程中断导致癌症和自身免疫疾病时,结果可能会受到破坏性。实现表观遗传调节的重要性导致了寻找能够靶向添加或去除表观遗传修正阳离子的酶的药物。为了进行筛选以鉴定影响表观遗传修饰酶的化合物,必须建立能够监测这些酶活性的可靠测定。CISBIO已经提供了许多试验,以检测组蛋白修正阳离子所涉及的酶的活性。这些酶分为两个广泛的课程:

  • 作者:添加甲基或乙酰基的酶
  • 擦除剂:去除甲基或乙酰基的酶

在这里,我们描述了Cisbio HTRF性能的验证®基于PHERAstar的分析FSBMG L德赢vwin官网客服ABTECH。


测定原则

该试验是一种组蛋白H3K9单甲基化试验,使用生物素化的肽段,包括组蛋白H3的1-21个残基,其中赖氨酸9作为底物未甲基化(图1)。

使用酶促步骤和检测步骤,无需在单孔中清洗即可进行检测。在酶的步骤底物中,酶G9a与S-(5’-腺苷)l -蛋氨酸氯(SAM)结合。在孵育过程中,活性酶将甲基转移到赖氨酸残基上,导致底物甲基化。通过添加Eu来检测修饰底物的量3 +-cryptate标记的抗H3K9 me1检测抗体和xl665结合链霉亲和素。抗体将特异性结合甲基化底物,并在HTRF供体(抗体)和受体(XL665)之间观察荧光共振能量转移。


材料与方法

  • H3K9单甲基化检测试剂及方案(Cisbio)
  • 384 well, small volume, white microplates (Greiner)
  • G9a(反应生物公司)
  • H3K9肽底物(AnaSpec)
  • Sam&Sah(Sigma)
  • UNC0646 & BIX01294 (R&D Systems)
  • PHERAstarFS(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)

在酶缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10 mM NaCl, 4 mM DTT, 0.01% Tween 20)中制备酶步工作溶液。将反应组装在384孔小体积板上,顺序如下:

  • 4 μl抑制剂或酶缓冲液
  • 2 μl G9a室温孵育5分钟
  • 4 μl substrate/SAM mix (seal plates and温育)
  • 检测混合液10 μl

加入检测混合液后,密封平板,室温孵育至少1小时。1小时后信号长时间稳定。使用PHERAstar进行检测FS使用标准的HTRF协议设置。


数据分析
HTRF比率(620nm处的665nm /信号的信号;结果乘以10,000),由MARS数据分析软件自动计算。


成绩与讨论

实验结果表明,当G9a浓度在0.125-0.25 nM范围内,反应时间为40 ~ 60分钟时,性能最佳。因此,本实验采用的G9a浓度为0.12 nM,反应时间为40分钟。为了验证性能,采用底物滴定法测定肽在本实验方案中的Km。本次滴定实验结果如图2所示。

通过测定已知的G9a抑制剂的活性,最终验证了G9a H3K9甲基化实验(图3)。

集成电路50从如图3所示的酶抑制曲线中计算出的值。的集成电路50结果如表1所示。表2比较了pherstar的读取时间FS当闪光数不同时。

表1:IC50三种不同的G9a抑制剂的值

抑制剂 集成电路50
BIX 01294 4.1μM
UNC 0646 6.2纳米
s 1.9μM


表2:384孔板后机匣激光条件变化的读取时间。

激光模式: 精确(27闪光) 快速(7闪光) 飞(1闪)
阅读时间: 2米32秒 48秒 21秒

结论

  • 的Cisbio HTRF®G9a组蛋白H3K9单甲基化实验为筛选这些在表观遗传调控中起核心作用的酶的抑制剂提供了一个很好的平台
  • 在pherstar上的分析性能FS是否使用底物,辅助因子和抑制剂滴定进行验证
  • 一个flash fly模式可以显著提高读取时间,从而提高吞吐量
  • 在一次flash fly模式下的优异表现可以归因于:
    • 紫外激光作为一种优良的激发源
    • HTRF®提供真正同时双发射检测的特定模块
    • 匹配的PMT指定用于TRF检测
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