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使用来自BMG LABTECH的酶标仪评估胰蛋白酶活性德赢vwin官网客服

W. Huang M.C. Cane D. Latawiec M. Awais J. Armstrong M. Chvanov D. n . cridle R. Sutton 皇家利物浦大学医院 05/2012
  • 胰蛋白酶活性作为使用荧光动力学测定监测的急性胰腺炎的措施
  • 与传统的分光光度计测量相比,微孔板读卡器提高了效率和生产率

表的内容

介绍

胰腺胰蛋白酶活性是用于评估体内和体外实验性急性胰腺炎的严重程度的常用生物标志物之一。目前,通过使用荧光测定法测量,使用分光光度计在其中在380nm处激发样品并在440nm处收集的排放量。虽然该方法提供了胰蛋白酶活性的精确测量,但它只允许测试每个时间点(约5分钟)的单个样品,并且需要相当多的胰蛋白酶衬底,这是昂贵的。BMG 德赢vwin官网客服Labtech酶标读者提供了测试胰胰蛋白酶活性的可能性,以最少体积的样品和染料以多阱格式,实时性。


测定原理

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,主要在赖氨酸或精氨酸的羧基侧裂解肽链。这一特性用于荧光法中测定胰蛋白酶的活性。已知胰蛋白酶底物Boc-Gln-Ala-Arg-MCA在氨基酸Arg(精氨酸)之后含有一种名为MCA(7-甲氧基香豆素-4-乙酸)的荧光染料。衬底裂解后,MCA染料被释放出来,并通过荧光强度被检测到。在本应用笔记中,不同的ex/em设置被用来检测胰蛋白酶活性。


材料与方法

  • 从CD1小鼠和C57BL / 6小鼠获得的正常和急性胰腺样品
  • 黑色96w平底微型板从Greiner
  • Boc-gln-Ala-Arg-MCA,肽,大阪,日本BMG Labtech的麦片读卡器德赢vwin官网客服

胰腺样品的制备
通过在组织均匀化缓冲液pH6.5中的冰上的电动均化器在冰上均化,含有(用mM)摩托的5,蔗糖250和硫酸镁的均化均化。将所得匀浆在1500g以1500g离心5分钟,将15μl的每种上清液加入到96孔微孔板中。


添加胰蛋白酶底物
将胰蛋白酶底物Boc-Gln-Ala-Arg-MCA加入pH 8.0的实验缓冲液中,其中含有(in mM) Tris 50、NaCl 150、CaCl21和0.1mg / ml牛血清白蛋白。基材的最终工作浓度为50μm。将混合物(285μL)加入酶标板中,允许通过基材切割胰蛋白酶。井中的最终体积为300μL。


检测胰蛋白酶活动
微孔板读卡器设置为动力模式(板模式)。将样品在380nm中激发,并在440nm处收集的排放至少5分钟。使用不同浓度(0-150μm)的市售猪胰蛋白酶(Sigma)产生标准曲线。标准和样品3分钟的荧光强度用于最终分析。根据底物转化率计算酶活性,并与井中的蛋白质含量有关。为了确定胰腺蛋白质浓度,使用BCA蛋白质测定(Thermo,Rockford,USA)测量562nm处的吸光度。


测试不同的激发和发射设置
酶标器进一步用于测试MCA的测定的不同激励和发射设置。在EX / EM 380/440旁边结合使用EX / EM 355/440组合,并获得了相应的标准曲线。

结果与讨论

检测胰蛋白酶活动
对于给出的猪胰蛋白酶浓度,微孔板读取器非常精确地读出(R2 = 0.9943),如图1所示。通过仪器精确地确定来自正常和急性胰腺炎的样品的胰腺胰蛋白酶活性。来自板读取器和光谱光度计(未示出的数据)的结果是高度相当的(k = 0.9147)。

用分光光度计测试几组样品需要几个小时的工作,而在读卡器上只需要10分钟就可以完成,因此该仪器大大提高了效率和生产率。在酶标仪中,每个样品只需要1.5 μL的底物,而在分光光度计中为10 μL。


测试不同的EX / EM组合
在文献中,不同的激发和发射波长用于确定样品中MCA的释放。尽管MCA的激发最大值处于较短波长,但最多描述了组合激发/发射380/440nm或380/460。由于还尝试了EX355 / 440过滤器组合。图2示出了在相同条件下为这两个不同的EX / EM组合获得的信号曲线。

与传统的380/440 ex/em波长相比,355/440 ex/em组合获得了更高的相对荧光值。但需要指出的是,空白值(t = 0时的RFU值)也明显更高。根据这些结果,当仅获得低信号时,最好选择355/440。


结论

在BMG Labtech介质读卡器中测试胰腺胰蛋白酶活性快速准确。德赢vwin官网客服它允许更高的样品吞吐量,并降低了在分光光度计中测试胰腺胰蛋白酶所需的昂贵耗材的费用。此外,通过这种仪器,在简单的软件支持的多区间测试不同的过滤器设置非常方便。德赢Vwin安全吗

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