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使用基于荧光的分析评估细胞外酸化

James Hynes(1)Conn Carey(1)Sinead Kriwan(1)凯瑟琳蜡(2) (1)安捷伦技术(2)BMG Labtech德赢vwin官网客服 10/2011
  • 时间分辨荧光法测定细胞外酸化
  • 测量丙酮酸转化为乳酸
  • 方便测量糖酵解流动

表的内容

介绍

代谢扰动在各种疾病状态和毒性中起着关键作用。了解两个主要细胞ATP产生途径之间的相互作用;因此,当检查这种扰动时,糖酵解和氧化磷酸化是特别提供的。在这里,我们描述了用于评估细胞外酸的基于时间分辨的流动性测定,其提供关于丙酮酸转化率与乳酸的数据的数据,因此是一种方便的糖酵解活性。当评估葡萄糖代谢的改变,检测糖酵解抑制和作为线粒体功能障碍的识别鉴定中的配置时,这种测定特别是信息。以下方案概述了使用FL荧光pH敏感探针,pH-XTRA和比率时间分辨的FORESPETION检测如何在标准微量滴定板上进行这种测量。这种方法过度地通过了与一些现有探针相关的校准和生物相容性问题,从而允许常规细胞培养和测定程序,同时还促进准确的定量分析。另外,与裂纹氧敏感探针的光谱相容性促进了多路复用的测量方法,提供了对测试细胞的综合代谢评估。

材料与方法

  • 清除Costar上96个孔板
  • 来自Agilent Technologies的PH-XTRA探头,pH-200-4
  • Microplate reader来自BMG 德赢vwin官网客服LABTECH

板材准备和阅读
温暖仪器测量温度(通常为30°C)。准备动力测量方案,在使用推荐的比率测量参数(“测量”部分中的更多细节)以2-4分钟内读取板以上以2-4分钟的间隔读取板。粘附细胞在L15培养基中的所示浓度下镀(a),并在CO中培养2- 免疫条件,37℃的95%湿度过夜或(b)在标准CO中培养过夜2孵化器然后在CO中保持2测量前2.5小时的自由条件。将pH-Xtra探针放入1ml密理波水中。温到测量温度。用测量缓冲液清洗细胞,小心不要将细胞从孔底脱落。在每个孔中加入150µL预加热的测量缓冲液,将板放在平衡到30°C的板加热器上。使用增音吸管,在每孔上加10µL pH-Xtra探针。如果适用,还可以添加药物。如果需要大量酸化数据,可以加油。

测量和数据分析
将微孔板插入微孔板读数器中。使用BMG LabTech脚本功能测量糖酵解活动。德赢vwin官网客服使用双延迟,时间分辨测量测量pH-XTRA探针。对于发射的激励和TR 615,最佳地波长为340 TR L.使用100和300μs的延迟时间,分别使用30μs的测量窗口。板材准备时间应保持最小。完成测量周期后,从仪器中取出板并将测量的数据保存到FIE。这些双强度测量用于使用以下功能计算发射寿命,τ= t2-t1 / ln(d2 / d1)[t =延迟时间,d =测量强度值]。使用默认校准作为MARS模板的一部分,使用寿命信号自动转换为pH和[H +]秤。脚本和协议可以通过当地的BMG LabTech代表性,MARS模板可供促进数据分析。德赢vwin官网客服

结果与讨论

监测细胞呼吸
pH-Xtra试验评估细胞呼吸作用的能力如图2所示。图2A给出了一个典型的数据,显示了96个单独样本的并行分析。HepG2的连续稀释如图2B所示,随着细胞数量的增加,酸化速率增加。这被看作是信号变化速率的增加。剖面具有高度的重复性,显示了<5%的%CV值。

结论

  • 通过测量细胞外acid酰胺的速率,可以在标准的96孔板上进行细胞糖糖型FL UX。
  • PPXTra探针促进的比例测量方法提供了鲁棒的测定读数。
  • 这样的测量可以方便地表征细胞代谢特征。
  • 当与氧气消耗分析一起评估时,可以进行线粒体功能的详细分析
  • 使用MARS数据分析模板大大简化了数据分析。

补充信息

1.当细胞在标准的5% CO中培养时2一个标准微量滴定板的聚苯乙烯体吸收一氧化碳2。如果一个板被立即从5%CO移动2本公司对测量室进行了检查2将扩散到样品中,导致酸酸。为了规避此,可以在CO中培养细胞2在特殊配制的培养基(如L-15)中培养,或在标准培养基中培养,并移至CO2- 在测量之前免费环境2h。Agilent用户指南中所述的过程。


2.测量缓冲液1:1mM k -磷酸盐,20mM葡萄糖,0.07M NaCl和0.05M KCl, 0.8mM, MgSO4.,2.4mm cacl.2, pH值7.4。测量缓冲液DMEM Base, 1.85g/l NaCl, 10ml 100x谷氨酰胺,10ml 100mM丙酮酸钠,15 mg苯酚红,25mM葡萄糖。


3.在未密封的样品中,酸化几乎完全是由于乳酸转化,而在密封的样品中,由于捕获的CO,碳酸的贡献很大2重新传播克雷布斯循环活动。

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