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自身发光细胞报告蜂窝新陈代谢的实时变化,以应对药理挑战

Kathryn Halter Dan关闭 490生物技术;诺克斯维尔,TN 02/2020
  • 490 Biotech提供表达合成的人源化细菌荧光素酶的自身发光细胞
  • 这些细胞自动调节输出强度并反映实时代谢活动
  • 使用ACU的Clariostar可以连续测量多天多天的代谢活性

介绍

生物发光是监测细胞内各种生物功能的有力工具。传统的生物荧光分析使用萤火虫(luc)或肾素(Rluc)荧光素酶。它们需要添加激活化学荧光素和破坏细胞样本。因此,系统产生的间歇性数据快照不能准确地表示细胞行为。然而,细菌荧光素酶是唯一已知的荧光素酶/荧光素合成途径在哺乳动物细胞最适温度37°C下功能的生物发光系统1。在这里,我们描述了表达细菌荧光素酶的哺乳动物细胞如何将终点荧光素酶测定转变为连续的动力学格式,从而产生更多信息的更多信息。


哺乳动物的动力学测量细胞生存能力响应药物治疗的代谢动力学是生物医学研究进展的基础。在该示例中,我们验证了使用内源性生物发光生产以响应于效率的抗生素Zeocin来跟踪活力。然后,我们认为连续监测可以通过用抗肿瘤药物椭圆形来揭示动态代谢效应。选择椭圆髓细胞,因为如Zeocin,它嵌入DNA。在高剂量下,它抑制线粒体中的电子转移,并通过耗尽ATP来影响细胞活力。然而,较低剂量令人不然的氧化磷酸化并增加代谢活性2

测定原则

通过检测细胞内特异性代谢物的存在,生物发光测定测量代谢活性。例如,LUC测定测量ATP含量,具有较高的ATP水平,表示增加的代谢活动。细菌荧光素酶测定类似地工作,具有FMNH2作为被测量的代谢物。大FMNH2可用性增加光输出,代表增加的代谢活动3.。490 Biotech提供市售的自身发光细胞,其表达细菌荧光素酶和荧光素合成途径所需的所有基因。因为两个组件都是内源性的,所以光线是连续产生的,而信号强度响应于FMNH的信号强度被组成思考2可用性。这允许通过光输出的测量实时地实时停止跟踪代谢活动。通过将信号强度与预处理基线进行比较,我们在发生时观察到对蜂窝函数的阳性,阴性或瞬态影响。

材料与方法

  • 白色,96孔板(康宁)
  • www.v66088.com (德赢vwin官网客服BMG Labtech)
  • Zeocin(Thermo Fisher Scientific)
  • ellipticine(透顶)
  • 自体荧光HEK293细胞(490生物技术)

实验的程序
将自身发射的HEK293细胞在100,000个细胞/孔中以三份接种,并在含有10%FBS的DMEM培养基中粘附在37℃下粘附24小时。随着Zeocin浓度(200-1,000μg/ ml)或椭圆形(500nm和5μm)的浓度挑战,细胞攻击。包括车辆控制以建立基线代谢活性。将微孔板立即置于ClarioStar酶标器中,并调节到ACU设定的大气条件4小时。监测生物发光输出两天以跟踪代谢活动和活力。


仪器设置

视镜设置 发光,极板模式,无滤镜
获得 3600
焦的高度 11.0毫米
常规设置 间隔时间 10 S.
建立时间 0
动力学设置 周期数 97.
周期 1800秒
孵化 30°c, 5% co2

成绩与讨论

与ACU的Clariostar与自我调制的自动发光细胞相结合,允许连续监测而长时间没有扰动。图2说明Zeocin根据预期的方式以剂量依赖的方式降低细胞活力。在每个治疗水平下,自动发射输出减少,在更高剂量下观察到的活力降低。如通过停止的自动发光所示,暴露于1,000μg/ ml暴露于1,000μg/ mL的细胞在后24小时内完全不可行。200μg/ ml Zeocin治疗抑制代谢活性,如通过自动发光的初始降低所示,但是由自身致发光的非效率细胞倍增的细胞被回收或被替换为24小时时间点。

自身发光细胞也能够露出阳性或瞬态代谢效果。为了证明这些效果,我们用抗肿瘤药物椭圆形挑战样品(图3)。正如预期的那样,代谢活性在低剂量(500nm)上增加。高剂量(5μm)最初抑制代谢活性。随着时间的推移,所提供的椭圆髓素被代谢,生物利用度降低,药物的效果从阴性转化为阳性。因为可以连续监测代谢,所以可以观察从单个样本集的情况下观察这些效果的时间和持续时间,而没有扰动。

结论

可以通过测量培养的人细胞中的自止动输出来实时进行对药物处理的细胞反应的评估。通过具有大气控制单元的ClarioStar微孔板读卡器可以提供这种方法,以提供细胞培养条件。因此,自动发射细胞允许连续监测细胞活力和药物代谢。这种增加的信息量可用于告知生物医学和药物开发研究。


参考

1. szittner r等人。由Lux基因从陆地细菌编码的荧光素酶的核苷酸序列,表达和性质。生物。化学。265,16581-16587(1990)。
2.Schwaller MA等。椭圆素和异构体跨线粒体能量转导膜的质子传递活性。生物。化学学报,270,22709 -22713(1995)。
3.接近,d。m。等。细菌荧光素酶基因盒(lux)在哺乳动物细胞系中的自主荧光表达。PLoS ONE 5, e12441(2010)。

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