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自身发光细胞报告蜂窝新陈代谢的实时变化,以应对药理挑战

Kathryn Halter Dan Close 490生物技术;诺克斯维尔,TN. 02/2020
  • 生物技术提供能表达合成的、人源细菌荧光素酶的自生发光细胞
  • 这些细胞自动调节输出强度并实时反映代谢活动
  • 使用ACU的Clariostar可以连续测量多天多天的代谢活性

介绍

生物发光是一种强大的工具,用于监测细胞内不同的生物学功能。传统的生物发光测定使用萤火虫(LUC)或Renilla(Rluc)荧光素酶。它们需要添加激活化学荧光素并破坏细胞样品。因此,系统产生不能准确地表示蜂窝行为的间歇数据快照。然而,细菌荧光素酶是唯一已知的生物发光系统,其具有遗传定义的荧光素酶/荧光素合成途径在哺乳动物细胞温度下的37°C1。在这里,我们描述了表达细菌荧光素酶的哺乳动物细胞如何将荧光素酶测定的终点转变为连续的、动态的形式,从而从更少的样本中产生更多的信息。


哺乳动物的动力学测量细胞活力药物治疗的代谢动力学反应是生物医学研究进展的基础。在这个例子中,我们验证了使用内源性生物荧光来跟踪对强效抗生素Zeocin的反应能力。我们随后表明,持续监测可以揭示抗肿瘤药物ellipticine治疗的动态代谢效应。选择Ellipticine是因为,像Zeocin一样,它插入DNA。高剂量时,它会抑制线粒体中的电子转移,并通过消耗ATP影响细胞活力。然而,低剂量解除氧化磷酸化并增加代谢活性2

测定原则

生物荧光法通过检测细胞内特定代谢物的存在来测量代谢活性。例如,luc测定ATP含量,较高的ATP水平代表增加的代谢活动。细菌荧光素酶测定与FMNH的工作原理类似2用作测量的代谢物。更大的FMNH.2可用性增加了光输出,代表了增加的代谢活动3.。490生物技术提供商用的能表达细菌荧光素酶和荧光素合成途径所需的所有基因的自生发光细胞。因为这两种成分都是内源性可利用的,所以当信号强度响应FMNH时,光被连续地产生2可用性。这允许通过光输出的测量实时地实时停止跟踪代谢活动。通过将信号强度与预处理基线进行比较,我们在发生时观察到对蜂窝函数的阳性,阴性或瞬态影响。

材料与方法

  • 白色96孔板(康宁)
  • www.v66088.com (德赢vwin官网客服BMG LABTECH)
  • Zeocin (Thermo Fisher Scientific)
  • Ellipticine (ApexBio)
  • 自动发射HEK293细胞(490 Biotech)

实验程序
将自发发光的HEK293细胞以10000个/孔的比例接种3个重复,并在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24小时。细胞受到Zeocin(200- 1000µg/mL)或ellipticine (500 nM和5µM)浓度的挑战。纳入对照以建立基线代谢活动。将微孔板立即放入CLARIOstar微孔板阅读器中,并根据ACU设定的大气条件进行4小时的调整。监测两天的生物荧光输出,以跟踪代谢活动和生存能力。


仪器的设置

光学设置 发光,板模式,没有过滤器
获得 3600
焦点 11.0毫米
一般设置 间隔时间 十年代
建立时间 0秒
动力学设置 数量的周期 97.
周期 1800年代
孵化 30°C,5%CO2

成绩与讨论

与ACU的Clariostar与自我调制的自动发光细胞相结合,允许连续监测而长时间没有扰动。图2说明Zeocin根据预期的方式以剂量依赖的方式降低细胞活力。在每个治疗水平下,自动发射输出减少,在更高剂量下观察到的活力降低。如通过停止的自动发光所示,暴露于1,000μg/ ml暴露于1,000μg/ mL的细胞在后24小时内完全不可行。200μg/ ml Zeocin治疗抑制代谢活性,如通过自动发光的初始降低所示,但是由自身致发光的非效率细胞倍增的细胞被回收或被替换为24小时时间点。

自身生物发光细胞应该能够揭示积极或短暂的代谢效应以及。为了证明这些作用,我们用抗肿瘤药物ellipticine对样品进行了测试(图3)。正如预期的那样,低剂量(500 nM)时代谢活性增加。高剂量(5µM)最初抑制代谢活性。随着时间的推移,所供应的ellipticine被代谢,生物利用度下降,药物的作用由负向正转变。因为代谢可以连续监测,所以可以从单一样本组观察这些影响的时间和持续时间而不受干扰。

结论

评估细胞对药物治疗的反应可以通过测量培养的人类细胞的自身发光输出实时进行。这是通过配备大气控制单元的CLARIOstar微孔板阅读器来提供细胞培养条件而实现的。因此,自生发光细胞可以持续监测细胞活力和药物代谢。这种增强的信息能力可用于为生物医学和药物开发研究提供信息。


参考资料

1.Szittner等人。陆生细菌lux基因编码的荧光素酶的核苷酸序列、表达和特性。生物。化学265,16581-16587(1990)。
2. Schwaller Ma等。线粒体能量转换膜的椭圆形和异构体的质子渗。生物。化学。270,22709-22713(1995)。
3.关闭,D. M.等人。哺乳动物细胞系中细菌荧光素酶基因盒(LUX)的自主生物发光表达。Plos一个5,E12441(2010)。

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