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粘合动力学:激酶抑制剂的高通量测定

Krumm A (1) Georgi V (2) Schiele F (2) Fernández-Montalván (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech GmbH(2)拜耳AG,药物发现,制药,柏林,德国 06/2020
  • 微孔板基于TR-FRET测定目标结合动力学速率k和k用于激酶抑制剂
  • pherstar的速度®提供高时间分辨率和高通量动力学表征
  • 筛选多抑制剂和激酶之间的相互作用涉及k和临床成功

介绍

药物开发是一个漫长而昂贵的过程,具有很高的损耗率。超过一半的候选药物进入2期临床试验,主要是因为缺乏有效性而失败1


与候选药物的疗效和安全性相关的一个特征是它们结合的速度(k)和解离(k),并据此确定它们可以占用它们的时间(停留时间)。在理想情况下,这些动力学参数在临床前阶段确定,需要对概况数百和数千种化合物的高通量方法。此外,来自不同临床开发阶段的现有分子的全面回顾性分析可以对靶结合动力学对药物药理谱的影响提供洞察。


在这里,我们介绍了K的确定和k在PHERAstar的价值FS.使用时间分辨FRET (TR-FRET)对癌症治疗中针对270种抑制剂的40个激酶药物靶点进行微效价平板阅读器。


测定原则

动力学探针竞争测定(KPCA)通过亲和试剂将与靶分子连接的基于镧系元素的供体荧光团的时间分辨能量转移(TR-FRET)检测到已知的受体染料共轭示踪剂(因此发现在Foerter距离内)。


为了确定绑定的动力学,首先通过监测互动伴侣的结合和解离期间监测TR - FRET信号的靶和荧光示踪件对。


一旦众所周知,众所周知跟踪器的关联和解离速率,可以在竞争性设置中针对未标记的化合物确定相同的参数,其中示踪剂和竞争对子分子同时暴露于目标。在这种情况下,竞争分子的结合改变了示踪剂与靶之间的相互作用的信号曲线,以剂量依赖的方式。


通过将所得信号拟合到适当的数学模型,可以推导出示踪剂和竞争者的动力学和亲和力参数3.(图。1)。

材料与方法

  • 激酶抑制剂(Selleckchem)
  • Alexa 647标记为激酶示踪剂(Thermoscietic)
  • 生物素化激酶(卡纳生物科学)
  • 链霉抗生物素蛋白 - 铽(CISBIO)
  • 黑色384小体积微孔板(Greiner)
  • PHERAstar®FS.(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)

实验程序
有关详细说明,请参阅Georgi等。(2018)4.。简单地说,我们准备了含有荧光示踪剂的5µl的检测板,不同浓度的竞争分子。将5µl的铽标记的激酶加入到用PHERAstar FS(带样品注射装置)的孔中,立即监测反应。

仪器的设置

光学设置 TR-FRET,板模式动力学在八圈中读数,顶视镜
过滤器 HTRF光学模块
一般设置 激励源 激光
闪光数量 5.
集成开始 100μs.
积分时间 400μs.
建立时间 0秒
动力学设置 数量的周期 41
周期时间 十年代

成绩与讨论

在第一步中,分析了荧光示踪剂与激酶(例如ABL)结合的关联和解离动力学。TR-FRET信号随时间增加,表明示踪激酶结合增加,而当信号被过量的未标记竞争对手取代时,信号减少(图2)。

接下来,用动力学探针竞争分析法分析一个未标记化合物。该反应包含荧光示踪剂178和指示浓度的staurosporine,一种未标记的abl粘合剂。反应开始时,加入tb标记的ABL,导致没有竞争对手时的信号增加(图3,灰色)。相比之下,竞争对手存在时的信号浓度越高,其浓度越低,随着时间的推移,信号的初始浓度增加后,信号的浓度随之降低。后者表明,由于较慢的绑定动力学竞争对手平衡更慢比示踪剂。


然后,该方法被用来确定在药物开发的不同阶段的270种激酶抑制剂的off-rate。它们与不同的激酶靶点上和靶点外相互作用的结合动力学参数(共量化了3230个相互作用)如图4所示。

该化合物在临床开发中越深入,缓慢解离相互作用的频率就越高(以高的负十进off-rate对数表示)。另一方面,该图显示,临床前化合物的关联率与批准药物的关联率几乎没有区别。总之,这些数据表明,激酶被化合物占据的时间越长,它成为临床有效药物的可能性就越大。


结论

基于tr - fret的动力学探针竞争分析测定了高通量未标记化合物的结合动力学。该方法允许将结合参数与临床成功联系起来,并根据其结合动力学特性选择开发的新药候选药物。


参考

范诺曼Ga等。(2019)DOI:10.1016 / j。Jacbts.2019.02.005
Schielef等人。(2015)DOI:10.1016 / J.AB.2014.09.007
3. Motulsky HJ,Mahan LC(1984)Mol Pharmacol。1984年1月; 25(1):1-9。
4. Georgi等人。(2018)DOI:10.1021 / JACS.8B08048

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