BMG Labtech的微孔板读卡器上的Biocolor的Apopercentage细胞德赢vwin官网客服凋亡测定

介绍

细胞凋亡是细胞内半胱天冬蛋白酶活性波动、DNA片段化、磷脂酰丝氨酸被转移到细胞膜外的多阶段过程。

常用的分析方法包括:

1.半胱天冬蛋白酶活性测定，可以是比色法，荧光法，发光法或基于抗体的。

2.基于DNA碎片的Turel测定。

3.基于染料的结合或荧光缀合的膜蛋白-V对凋亡的磷脂酰丝氨酸的结合，其基于染料或荧光缀合的附属肽丝氨酸。

使用碘化丙烯酸铅必须区分坏死的细胞。

不透明原则
将磷脂酰丝氨酸的转移和暴露于细胞膜的外表面已与凋亡的发生有关。磷脂酰丝氨酸跨膜运动导致凋亡的诱发细胞吸收缺陷症染料。染料摄取仍在继续，直到发生凋亡的诱发细胞的批发。然后，没有进一步的染料可以进入粘附的细胞和累积在细胞内的染料未被释放。坏死细胞不保留染料。可以使用光学显微镜计算染料细胞，或者可以从细胞中释放染料并如下所述的方法分光光度测量。

材料与方法

• 最低细胞培养设备
• 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器
• 24孔和96孔微板

协议

1.在5 × 10的24孔组织培养板上播种⁴细胞/孔置于500 μL培养基中，37℃/5% CO孵育₂，直到达到汇合（〜24小时）。

2.按照以下建议的布局，在选定的浓度下准备稀释的测试凋亡剂。每项实验都应包括对照(-ve和+ve)。

reag。空白	reag。空白	- 控制	- 控制	+ ve控制	+ ve控制
样品1	样品1	样品4.	样品4.	样本7.	样本7.
样品2	样品2	样品5.	样品5.	样品8.	样品8.
样品3.	样品3.	样品6.	样品6.	样本9.	样本9.

3.组成双量值A.使用一半的体积来制备试剂B.

	试剂A. (500μL /)	试剂B. (500μL /)
试剂空白	培养基/血清	试剂A.
阴性对照（0％细胞凋亡）	培养基/血清	试剂A + 5％v / v染料
阳性对照（100％凋亡）	培养基/血清+参考凋亡剂	试剂A + 5％v / v染料
测试样品（> 0％，<100％）	培养基/血清+试验凋亡剂	试剂A + 5％v / v染料

4.培养板每孔取出培养基，各孔加500 μL试剂A，必要时加血清v/v。

5.凋亡诱导剂/抑制剂的孵育时间取决于所用的凋亡剂。在达到该时间段之前30分钟除去试剂A.立即用500μL试剂B替换并孵育剩余30分钟，在37℃/ 5％CO₂。

6.使用移液管从每个孔中取出试剂B.用1000μL/孔PBS轻轻洗涤细胞两次以除去非细胞结合染料。（注意：建议仔细渴望，因为一些凋亡剂可能导致脱离和丧失细胞）。

7.将胰蛋白酶（50μl）添加到每个孔中，并在37℃/ 5％CO中孵育10分钟₂。5分钟后用手轻拍平板，10分钟后再次将细胞从塑料上分离，细胞培养处理过的表面。

现在，向每个孔中加入200μL染料释放试剂并摇动板10分钟。

9.将各孔的含量(250 μL)转移到96孔的平板上，在550 nm处读出吸光度。孔中气泡影响结果，用干净的引脚爆开或转移200 μL而不是250 μL到微孔板。

这个实验是用三倍的样品进行的。

仪器设置

测量类型:	吸光度
不。每口井闪光次数:	22.
激励:	550 nm.
摇动频率（RPM）：	300
摇动模式：	双轨道
额外的摇晃时间：	3秒钟之前阅读
定位延迟：	0.2

结果与讨论

1.按照上述协议获取吸收数据。
2.从测试结果中减去试剂空白重复的平均值。
3.在柱状图(图1)中绘制平均吸光度值±平均值的标准误差或以阳性对照吸光度值的百分比表示。