Bluescreen HC - 基于发光，高通量，体外遗传毒性测定

介绍

蓝调HC.^TM值Gentronix Ltd.的基因毒性测定使用人源性P53竞争力的TK6细胞系来举办基于发光的报告系统，该系统利用了GADD45A基因的适当调节。该测定产生直接作用致动致动致动作用致抗体和裂纹的阳性结果，以及间接地的化合物和拓扑异构酶和聚合酶抑制剂，其干扰DNA复制，维护，修理和分离的过程。重要的是，对于非致癌物质产生了正确的负面结果，其中许多是误导阳性结果体外基因毒性测试。在蓝晶HC S9中，测定使用啮齿动物肝提取物的代谢活化方案（S9）延伸检测到的化合物的范围包括遗传毒性代谢物。S9含有细胞色素P450s和催化异卵物质的解毒的其他酶。

蓝晶HC测定法利用来自海洋桡足蛋白酶的荧光素酶高斯Princeps产生发光输出。暴露于遗传毒性化学物质导致GADD45a的表达增加，因此来自GADD45A报告者的荧光素酶产生的剂量依赖性增加，其自然地从细胞出口。通过注射底物，Coelentazine的溶液来评估由细胞产生的荧光素酶的量，从而产生短寿命的闪光发光。此外，通过蓝晶HC测定中的光学吸光度的变化或来自蓝晶HC S9测定中的DNA染色中的光学吸光度的变化来评估细胞毒性的量度降低的细胞毒性。

材料与方法

• Bluescreen HC和Bluescreen HC S9试剂盒和细胞系
• 蓝屏HC - 黑色，清晰的平底，无菌，96孔微孔板，来自Thermo Scientific Matrix
• Bluescreen HC S9 - 黑色，坚固的圆底，无菌，来自Greiner Bio-One的96孔微孔板

测定微孔板的制备
将遗传修饰的报告细胞保持在基于RPMI的培养基中，并生长至0.5和1.2×10之间的密度^6.细胞/ ml为测定制备。4试验制品（即纯化学物质，复合混合物或产物制剂）在8个序列（2倍）稀释液中，与适当的遗传毒性阳性对照，在一个96孔微孔板中测试。在将测试化合物排列成两份，在2×10的密度的相等体积（75μL）的生长细胞^6.将细胞/ mL加入到柱1至11中的每个孔中。用透气膜覆盖微孔板，并在37℃下孵育5％CO₂和95％的湿度而不摇晃。对于没有S9的研究代谢激活，将微孔板孵育48小时。对于掺入S9代谢活化的研究，将S9加入到含有1％v / v S9的终浓度的微孔板的每个孔中。3小时后，洗涤细胞，然后再悬浮在新鲜回收介质中另外45小时。

蓝屏HC和蓝色屏幕HC S9参数S9参数进行摇动以在测量前重新悬挂细胞。对于蓝晶HC测定（没有S9），首先使用吸光度测量评估微孔板孔以确定细胞密度，然后使用闪光发光来量化荧光素酶表达。对于蓝晶HC S9测定，首先定量荧光素酶表达，然后使用噻唑橙在与DNA结合时荧光的含噻唑橙的细胞裂解和评估细胞密度。与未处理的细胞相比降低的细胞密度提供了细胞毒性的量度。校正细胞密度的发光强度与GADD45a的表达成比例，从而对测试制品的遗传毒性。表1总结了在不存在和存在S9的情况下协议之间的差异。

仪器设置：

• 吸光度：每孔20次闪光灯620nm。
• 荧光：激发485nm，发射520nm，最佳增益，顶部读数和10次闪烁。
• 发光：“井模式”，顺序地注入，摇动和读取每个井。使用内置的试剂注射器以260μl/ s的速度注入50μl的2.5μm的Coelentazine溶液。然后立即将微孔板摇动1 s（500rpm，轨道），然后用5 s的整合时间记录发光。

表1：蓝屏HC测定方案，在没有或存在S9分数的情况下运行。

	蓝屏HC.	蓝屏HC S9具有代谢激活
代谢激活	-	1％v / v S9分数
孵化时间	暴露 - 48小时	暴露 - 3小时/恢复 - 45小时
阳性对照化合物	4-硝基喹啉氧化物（0.5和0.125μg/ ml）	环磷酰胺（25和5μg/ ml）
荧光素酶测定	闪光发光
相对细胞密度评估	光学吸光度	DNA染色荧光
微孔板	黑色，清晰 平底， 无菌，96孔	黑色，坚实 圆底底， 无菌，96孔

数据处理
吸光度，荧光和发光读数直接导出到Gentronix提供的基于Excel的软件模板中。该软件提供自动决定（即正，阴性），定量结果（即最低有效浓度）和遗传毒性和相关细胞毒性终点的清晰图形剂量响应数据。含有测试制品的孔的结果相对于载体（稀释剂）处理的对照进行缩放。阳性结果根据统计学衍生的阈值来定义，用于增加遗传毒性的发光诱导和细胞毒性相对细胞密度的降低。

成绩与讨论

用不同的毒性特性测试一系列化合物。