218.

Bluescreen HC - 基于发光,高通量,体外遗传毒性测定

Andrew Knight Chris Hughes Matthew Tate Gentronix Ltd. 08/2011
  • 在各种试验文章中快速准确地检测遗传毒性责任的议定书
  • 测试制品包括药品,工业化学品和个人护理产品
  • 使用闪光发光,吸光度和荧光同时测量基因毒性和细胞毒性

介绍

蓝调HC.TM值Gentronix Ltd.的基因毒性测定使用人源性P53竞争力的TK6细胞系来举办基于发光的报告系统,该系统利用了GADD45A基因的适当调节。该测定产生直接作用致动致动致动作用致抗体和裂纹的阳性结果,以及间接地的化合物和拓扑异构酶和聚合酶抑制剂,其干扰DNA复制,维护,修理和分离的过程。重要的是,对于非致癌物质产生了正确的负面结果,其中许多是误导阳性结果体外基因毒性测试。在蓝晶HC S9中,测定使用啮齿动物肝提取物的代谢活化方案(S9)延伸检测到的化合物的范围包括遗传毒性代谢物。S9含有细胞色素P450s和催化异卵物质的解毒的其他酶。


蓝晶HC测定法利用来自海洋桡足蛋白酶的荧光素酶高斯Princeps产生发光输出。暴露于遗传毒性化学物质导致GADD45a的表达增加,因此来自GADD45A报告者的荧光素酶产生的剂量依赖性增加,其自然地从细胞出口。通过注射底物,Coelentazine的溶液来评估由细胞产生的荧光素酶的量,从而产生短寿命的闪光发光。此外,通过蓝晶HC测定中的光学吸光度的变化或来自蓝晶HC S9测定中的DNA染色中的光学吸光度的变化来评估细胞毒性的量度降低的细胞毒性。

材料与方法

  • Bluescreen HC和Bluescreen HC S9试剂盒和细胞系
  • 蓝屏HC - 黑色,清晰的平底,无菌,96孔微孔板,来自Thermo Scientific Matrix
  • Bluescreen HC S9 - 黑色,坚固的圆底,无菌,来自Greiner Bio-One的96孔微孔板

测定微孔板的制备
将遗传修饰的报告细胞保持在基于RPMI的培养基中,并生长至0.5和1.2×10之间的密度6.细胞/ ml为测定制备。4试验制品(即纯化学物质,复合混合物或产物制剂)在8个序列(2倍)稀释液中,与适当的遗传毒性阳性对照,在一个96孔微孔板中测试。在将测试化合物排列成两份,在2×10的密度的相等体积(75μL)的生长细胞6.将细胞/ mL加入到柱1至11中的每个孔中。用透气膜覆盖微孔板,并在37℃下孵育5%CO2和95%的湿度而不摇晃。对于没有S9的研究代谢激活,将微孔板孵育48小时。对于掺入S9代谢活化的研究,将S9加入到含有1%v / v S9的终浓度的微孔板的每个孔中。3小时后,洗涤细胞,然后再悬浮在新鲜回收介质中另外45小时。


蓝屏HC和蓝色屏幕HC S9参数S9参数进行摇动以在测量前重新悬挂细胞。对于蓝晶HC测定(没有S9),首先使用吸光度测量评估微孔板孔以确定细胞密度,然后使用闪光发光来量化荧光素酶表达。对于蓝晶HC S9测定,首先定量荧光素酶表达,然后使用噻唑橙在与DNA结合时荧光的含噻唑橙的细胞裂解和评估细胞密度。与未处理的细胞相比降低的细胞密度提供了细胞毒性的量度。校正细胞密度的发光强度与GADD45a的表达成比例,从而对测试制品的遗传毒性。表1总结了在不存在和存在S9的情况下协议之间的差异。


仪器设置:

  • 吸光度:每孔20次闪光灯620nm。
  • 荧光:激发485nm,发射520nm,最佳增益,顶部读数和10次闪烁。
  • 发光:“井模式”,顺序地注入,摇动和读取每个井。使用内置的试剂注射器以260μl/ s的速度注入50μl的2.5μm的Coelentazine溶液。然后立即将微孔板摇动1 s(500rpm,轨道),然后用5 s的整合时间记录发光。

表1:蓝屏HC测定方案,在没有或存在S9分数的情况下运行。

蓝屏HC. 蓝屏HC S9具有代谢激活
代谢激活 - 1%v / v S9分数
孵化时间 暴露 - 48小时 暴露 - 3小时/恢复 - 45小时
阳性对照化合物 4-硝基喹啉氧化物(0.5和0.125μg/ ml) 环磷酰胺(25和5μg/ ml)
荧光素酶测定 闪光发光
相对细胞密度评估 光学吸光度 DNA染色荧光
微孔板 黑色,清晰
平底,
无菌,96孔
黑色,坚实
圆底底,
无菌,96孔

数据处理
吸光度,荧光和发光读数直接导出到Gentronix提供的基于Excel的软件模板中。该软件提供自动决定(即正,阴性),定量结果(即最低有效浓度)和遗传毒性和相关细胞毒性终点的清晰图形剂量响应数据。含有测试制品的孔的结果相对于载体(稀释剂)处理的对照进行缩放。阳性结果根据统计学衍生的阈值来定义,用于增加遗传毒性的发光诱导和细胞毒性相对细胞密度的降低。


成绩与讨论

用不同的毒性特性测试一系列化合物。

表2中给出了蓝晶HC结果,包括2个基因毒素(甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉氧化物)和1个细胞毒性非遗传毒素(2,4-二氯苯酚)。Bluescreen HC S9结果如图1和表3所示,包括3个促毒毒性化学品,其在S9存在下形成基因毒性代谢物。

表2:4个试验制品的细胞毒性和遗传毒性结果,在蓝晶HC测定中筛选。LEC =最低有效浓度。

测试文章 浓度(μg/ ml) 细胞毒性 LEC(μg/ ml) 基因毒性 LEC(μg/ ml)
甲磺酸甲酯 50. 积极的 12.5 积极的 6.25
4-硝基喹啉氧化物 1 积极的 0.25 积极的 0.13
2,4-二氯苯酚 324. 积极的 40.5 消极的 -
车辆控制 - 消极的 - 消极的 -

表3:4个试验制品的细胞毒性和遗传毒性结果,筛选在蓝晶HC S9测定中,掺入外源代谢活化以检测遗传毒性代谢物。LEC =最低有效浓度。

测试文章 浓度(μg/ ml) 细胞毒性 LEC(μg/ ml) 基因毒性 LEC(μg/ ml)
黄曲霉毒素 1.25 积极的 0.08 积极的 0.04
6- aminochrysene. 40 积极的 5. 积极的 2.5
苯并[a]芘 20. 积极的 5. 积极的 2.5
车辆控制 - 消极的 - 消极的 -

对于这些特征良好的化合物获得的LEC是相同或在1次血液稀释中的历史对照,并且在重复之间的高度一致。


结论

这里示出了蓝晶HC和蓝色屏幕HC S9测定与使用3个主检测模式和试剂注射系统的BMG Labtech微孔板读卡器高度兼容。德赢vwin官网客服使用仪器,Bluescreen HC测定已显示出快速,准确,可重复,可在广泛的化学品的遗传毒性责任的遗传毒性责任中进行快速,准确和可重复,具有不同的效力和作用方式。

去顶级