Bluescreen HC - 基于发光，高通量，体外遗传毒性测定

介绍

蓝调HC.^TMGentronix有限公司的基因毒性试验使用一种人类来源的具有p53活性的TK6细胞系宿主一个基于发光的报告系统，该系统利用GADD45a基因的适当调控。对于直接作用的诱变剂和破裂剂，以及间接作用的化合物，如非真异构体，以及干扰DNA复制、维护、修复和分离过程的拓扑异构酶和聚合酶抑制剂，该试验产生阳性结果。重要的是，对非致癌物产生正确的阴性结果，而许多非致癌物在其它方面产生误导的阳性结果体外基因毒性测试。在BlueScreen HC S9检测中，使用鼠肝提取物(S9)的代谢激活协议扩展了化合物的检测范围，包括基因毒性代谢物。S9含有细胞色素p450和其他酶，催化解毒的外来生物物质。

蓝幕HC检测利用了一种来自海洋桡足类的荧光素酶高斯产生发光输出。暴露于一种基因毒性化学物质会导致GADD45a表达增加，从而导致GADD45a报告基因荧光素酶产量的剂量依赖性增加，而荧光素酶是自然从细胞中输出的。细胞产生的荧光素酶的数量是通过注射底物的溶液，腔肠嗪来评估的，导致短暂的闪光发光。此外，通过蓝屏HC测定法中光吸收的变化或蓝屏HC S9测定法中DNA染色的荧光来评估细胞增殖减少(一种细胞毒性的测量方法)。

材料与方法

• Bluescreen HC和Bluescreen HC S9试剂盒和细胞系
• 蓝屏HC -黑色，透明平底，无菌，96孔microplates from Thermo Scientific Matrix
• BlueScreen HC S9 -黑色，实心圆底，无菌，96孔Greiner Bio-One微孔板

微孔板的制备
将遗传修饰的报告细胞保持在基于RPMI的培养基中，并生长至0.5和1.2×10之间的密度^6.细胞/ ml为测定制备。4试验制品（即纯化学物质，复合混合物或产物制剂）在8个序列（2倍）稀释液中，与适当的遗传毒性阳性对照，在一个96孔微孔板中测试。在将测试化合物排列成两份，在2×10的密度的相等体积（75μL）的生长细胞^6.将细胞/ mL加入到柱1至11中的每个孔中。用透气膜覆盖微孔板，并在37℃下孵育5％CO₂95%湿度无晃动。对于没有S9代谢激活的研究，微孔板孵育48小时。对于合并S9代谢激活的研究，将S9以最终浓度为1% v/v S9的浓度加入到含有细胞的孔板的每孔中。3小时后，细胞被清洗，然后在新鲜的恢复介质中再悬浮45小时。

蓝屏HC和蓝色屏幕HC S9参数S9参数进行摇动以在测量前重新悬挂细胞。对于蓝晶HC测定（没有S9），首先使用吸光度测量评估微孔板孔以确定细胞密度，然后使用闪光发光来量化荧光素酶表达。对于蓝晶HC S9测定，首先定量荧光素酶表达，然后使用噻唑橙在与DNA结合时荧光的含噻唑橙的细胞裂解和评估细胞密度。与未处理的细胞相比降低的细胞密度提供了细胞毒性的量度。校正细胞密度的发光强度与GADD45a的表达成比例，从而对测试制品的遗传毒性。表1总结了在不存在和存在S9的情况下协议之间的差异。

仪器设置:

• 吸光度:620 nm，每孔20次闪光。
• 荧光：激发485nm，发射520nm，最佳增益，顶部读数和10次闪烁。
• 发光:“井模式”，依次注入、震动和读取每口井。用内装式进样器以260 μL/s的速度向井中注入2.5 μM的腔enterazine溶液50 μL。然后将微孔板立即震荡1 s (500 rpm，轨道)，然后记录发光，积分时间为5 s。

表1：蓝屏HC测定方案，在没有或存在S9分数的情况下运行。

	蓝屏HC.	蓝屏HC S9具有代谢激活
代谢激活	-	1% v/v S9馏分
培养时间	暴露 - 48小时	暴露- 3小时/恢复- 45小时
积极控制复合	4-硝基喹啉氧化物（0.5和0.125μg/ ml）	环磷酰胺(25和5 μg/mL)
荧光素酶测定	闪光发光
相对细胞密度评估	光的吸光度	DNA染色荧光
微型板块	黑色的,明确的 平底的, 无菌，96孔	黑色,固体 圆底, 无菌，96孔

数据处理
吸光度，荧光和发光读数直接导出到Gentronix提供的基于Excel的软件模板中。该软件提供自动决定（即正，阴性），定量结果（即最低有效浓度）和遗传毒性和相关细胞毒性终点的清晰图形剂量响应数据。含有测试制品的孔的结果相对于载体（稀释剂）处理的对照进行缩放。阳性结果根据统计学衍生的阈值来定义，用于增加遗传毒性的发光诱导和细胞毒性相对细胞密度的降低。

成绩与讨论

用不同的毒性特性测试一系列化合物。