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Bluescreen HC - 基于发光,高通量,体外遗传毒性测定

Andrew Knight Chris Hughes Matthew Tate Gentronix有限公司 08/2011
  • 在各种试验文章中快速准确地检测遗传毒性责任的议定书
  • 测试制品包括药品,工业化学品和个人护理产品
  • 使用闪光发光,吸光度和荧光同时测量基因毒性和细胞毒性

介绍

蓝调HC.TMGentronix有限公司的基因毒性试验使用一种人类来源的具有p53活性的TK6细胞系宿主一个基于发光的报告系统,该系统利用GADD45a基因的适当调控。对于直接作用的诱变剂和破裂剂,以及间接作用的化合物,如非真异构体,以及干扰DNA复制、维护、修复和分离过程的拓扑异构酶和聚合酶抑制剂,该试验产生阳性结果。重要的是,对非致癌物产生正确的阴性结果,而许多非致癌物在其它方面产生误导的阳性结果体外基因毒性测试。在BlueScreen HC S9检测中,使用鼠肝提取物(S9)的代谢激活协议扩展了化合物的检测范围,包括基因毒性代谢物。S9含有细胞色素p450和其他酶,催化解毒的外来生物物质。


蓝幕HC检测利用了一种来自海洋桡足类的荧光素酶高斯产生发光输出。暴露于一种基因毒性化学物质会导致GADD45a表达增加,从而导致GADD45a报告基因荧光素酶产量的剂量依赖性增加,而荧光素酶是自然从细胞中输出的。细胞产生的荧光素酶的数量是通过注射底物的溶液,腔肠嗪来评估的,导致短暂的闪光发光。此外,通过蓝屏HC测定法中光吸收的变化或蓝屏HC S9测定法中DNA染色的荧光来评估细胞增殖减少(一种细胞毒性的测量方法)。

材料与方法

  • Bluescreen HC和Bluescreen HC S9试剂盒和细胞系
  • 蓝屏HC -黑色,透明平底,无菌,96孔microplates from Thermo Scientific Matrix
  • BlueScreen HC S9 -黑色,实心圆底,无菌,96孔Greiner Bio-One微孔板

微孔板的制备
将遗传修饰的报告细胞保持在基于RPMI的培养基中,并生长至0.5和1.2×10之间的密度6.细胞/ ml为测定制备。4试验制品(即纯化学物质,复合混合物或产物制剂)在8个序列(2倍)稀释液中,与适当的遗传毒性阳性对照,在一个96孔微孔板中测试。在将测试化合物排列成两份,在2×10的密度的相等体积(75μL)的生长细胞6.将细胞/ mL加入到柱1至11中的每个孔中。用透气膜覆盖微孔板,并在37℃下孵育5%CO295%湿度无晃动。对于没有S9代谢激活的研究,微孔板孵育48小时。对于合并S9代谢激活的研究,将S9以最终浓度为1% v/v S9的浓度加入到含有细胞的孔板的每孔中。3小时后,细胞被清洗,然后在新鲜的恢复介质中再悬浮45小时。


蓝屏HC和蓝色屏幕HC S9参数S9参数进行摇动以在测量前重新悬挂细胞。对于蓝晶HC测定(没有S9),首先使用吸光度测量评估微孔板孔以确定细胞密度,然后使用闪光发光来量化荧光素酶表达。对于蓝晶HC S9测定,首先定量荧光素酶表达,然后使用噻唑橙在与DNA结合时荧光的含噻唑橙的细胞裂解和评估细胞密度。与未处理的细胞相比降低的细胞密度提供了细胞毒性的量度。校正细胞密度的发光强度与GADD45a的表达成比例,从而对测试制品的遗传毒性。表1总结了在不存在和存在S9的情况下协议之间的差异。


仪器设置:

  • 吸光度:620 nm,每孔20次闪光。
  • 荧光:激发485nm,发射520nm,最佳增益,顶部读数和10次闪烁。
  • 发光:“井模式”,依次注入、震动和读取每口井。用内装式进样器以260 μL/s的速度向井中注入2.5 μM的腔enterazine溶液50 μL。然后将微孔板立即震荡1 s (500 rpm,轨道),然后记录发光,积分时间为5 s。

表1:蓝屏HC测定方案,在没有或存在S9分数的情况下运行。

蓝屏HC. 蓝屏HC S9具有代谢激活
代谢激活 - 1% v/v S9馏分
培养时间 暴露 - 48小时 暴露- 3小时/恢复- 45小时
积极控制复合 4-硝基喹啉氧化物(0.5和0.125μg/ ml) 环磷酰胺(25和5 μg/mL)
荧光素酶测定 闪光发光
相对细胞密度评估 光的吸光度 DNA染色荧光
微型板块 黑色的,明确的
平底的,
无菌,96孔
黑色,固体
圆底,
无菌,96孔

数据处理
吸光度,荧光和发光读数直接导出到Gentronix提供的基于Excel的软件模板中。该软件提供自动决定(即正,阴性),定量结果(即最低有效浓度)和遗传毒性和相关细胞毒性终点的清晰图形剂量响应数据。含有测试制品的孔的结果相对于载体(稀释剂)处理的对照进行缩放。阳性结果根据统计学衍生的阈值来定义,用于增加遗传毒性的发光诱导和细胞毒性相对细胞密度的降低。


成绩与讨论

用不同的毒性特性测试一系列化合物。

表2中给出了蓝晶HC结果,包括2个基因毒素(甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉氧化物)和1个细胞毒性非遗传毒素(2,4-二氯苯酚)。Bluescreen HC S9结果如图1和表3所示,包括3个促毒毒性化学品,其在S9存在下形成基因毒性代谢物。

表2:4个试验制品的细胞毒性和遗传毒性结果,在蓝晶HC测定中筛选。LEC =最低有效浓度。

测试文章 浓度(μg/ ml) 细胞毒性 LEC(μg / mL) 基因毒性 LEC(μg / mL)
甲磺酸甲酯 50 积极的 12.5 积极的 6.25
4-Nitroquinoline氧化 1 积极的 0.25 积极的 0.13
2, 4-Dichlorophenol 324 积极的 40.5 -
车辆控制 - - -

表3:蓝屏HC S9法筛选的4篇试验文章的细胞毒性和基因毒性结果,并结合外源性代谢激活检测基因毒性代谢物。LEC =最低有效浓度。

测试文章 浓度(μg/ ml) 细胞毒性 LEC(μg / mL) 基因毒性 LEC(μg / mL)
黄曲霉毒素 1.25 积极的 0.08 积极的 0.04
6- aminochrysene. 40 积极的 5. 积极的 2.5
苯并[a]芘 20. 积极的 5. 积极的 2.5
车辆控制 - - -

对于这些特征良好的化合物获得的LEC是相同或在1次血液稀释中的历史对照,并且在重复之间的高度一致。


结论

BlueScreen HC和BlueScreen HC S9检测方法在这里显示与BMG LABTECH酶标仪高度兼容,利用了3种主要的检测模式和试剂注入系统。德赢vwin官网客服使用该仪器的蓝屏HC测定已被证明是快速,准确和可重复的检测和定量的遗传毒性的化学品不同的效力和作用模式的广泛范围。

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