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钙保留能力测定评估线粒体渗透性过渡孔的抑制

阿维斯D.拉塔维茨R.萨顿 英国利物浦大学转化医学研究所,利物浦胰腺炎研究组 11/2017
  • 钙潴留能力是衡量线粒体功能的指标
  • MPTP抑制剂的能力和剂量依赖性以高吞吐量测量
  • 北极星®欧米茄可以多次注射和荧光钙sens的动力学评估

表的内容

介绍

线粒体功能障碍是急性胰腺炎以及心脏、大脑和肾脏缺血再灌注损伤、肌肉营养不良和神经退行性病变等疾病发病机制的核心1-3。线粒体功能障碍是线粒体内膜(IMM)通透性突然增加的结果,通过一个称为线粒体通透性过渡孔(MPTP)的多蛋白通道持续打开。1。这允许不受控制的质子流过IMM和不受调节的流量的水,离子和溶质高达1.5 kDa进出线粒体基质。这导致了ATP产生所必需的线粒体内膜电位的丧失,钙稳态的破坏,线粒体和线粒体外膜(OMM)的肿胀。最终,细胞开始通过不受控制的坏死方式死亡4。因此,MPTP可能成为维持线粒体功能和预防多种疾病状态下细胞死亡的一个有吸引力的靶点。

MPTP的开放及其抑制作用可以通过测定线粒体对钙绿色的钙保留能力(CRC)来评估TM-5N是一种低亲和膜不透染料,与钙结合后荧光发射强度增加(图1)。


在脱模间隔中将固定体积的氯化钙体积添加到样品(线粒体悬浮液)中,每个都引发信号中的尖峰,其由于钙的摄取到线粒体基质中而耗散。MPTP的打开塌陷线粒体膜电位,这导致累积钙从基质中释放,导致突然且持续增加FORESCASCE信号(图2)。

材料与方法

  • 新鲜分离的肝线粒体
  • Green-5N钙(分子探针)
  • 氯化钙(σ)
  • 感兴趣的抑制剂
  • 黑色96孔微孔板(Greiner)
  • 北极星Omega (BMG LAB德赢vwin官网客服TECH)

实验的程序
在荧光Ca存在的情况下,每4分钟向小鼠肝线粒体中加入钙2 +指示灯,绿色钙5N。随后测量线粒体外钙绿色荧光,直到MPTP打开。在开始Ca之前,每个抑制剂都被加入线粒体中2 +的实验。


仪器设置

光学设置 荧光强度,平板模式动力学
过滤器 激励485.
530年发射
获得1800
一般设置 闪烁次数10
设定时间0.1 s
动态设置 160个周期数
循环时间30 s
孵化 25°C
注入的设置 智能分配使用
泵容积4µl
泵速300µl/s
注射周期4

结果与讨论

主要是持续性线粒体基质Ca2 +过载触发器延长了高电导MPTP开口。因此,使用分离的线粒体的CRC测定是MPTP抑制剂的表型筛选的优异工具。如图2所示,不同的抑制剂抵抗MPTP的打开到不同的范围。有希望的候选人可以以浓度依赖方式进行测试。如图3所示,一种铅抑制剂在CRC测定中以浓度依赖性方式显示MPTP抑制。

结论

CRC检测是一种高通量检测方法,用于MPTP抑制剂筛选与北极星Omega微孔板阅读器。该方法也可用于活透细胞。由于多次注射和短的荧光峰值,需要一个具有快速和灵敏检测荧光强度的注射器的稳健的微孔板阅读器来读取分析结果。北极星欧米茄已经被证明能够满足这些要求。此外,酶标仪通过其控制软件的直观操作有助于运行这样复杂的分析。


参考文献

1. Bernardi P,Lisa FD(2015)线粒体渗透过渡孔:分子性质和作用作为心脏保护靶的靶标。J.Mol。细胞。心肺。78,100-106。
2.Rao VK, Carlson EA, Yan SS(2014)线粒体通透性过渡孔是神经变性的潜在药物靶点。Biochim。Biophys。学报,1842,1267 - 72。
3. Mukherjee R等人。(2016)线粒体渗透过渡孔隙诱导和胰腺损伤机制:抑制通过保护ATP的生产来防止急性胰腺炎。GUT 65,1333-46。
4.Nakagawa T等(2005)亲环素d依赖的线粒体通透性转变可调节部分坏死而非凋亡细胞死亡。434年自然,652 - 8。

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