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钙保留能力试验评价线粒体渗透性过渡孔的抑制

M. Awais D. Latawiec R. Sutton 英国利物浦大学转化医学研究所利物浦胰腺炎研究组 11/2017
  • 钙保留容量是线粒体功能的量度
  • MPTP抑制剂的容量和剂量依赖性在高通量测量
  • POLARstar®欧米茄使多次注射和流动评估的流动性钙钙感启动

介绍

线粒体功能障碍是急性胰腺炎的发病机制以及其他疾病,包括心脏,脑和肾,肌营养不良和神经变性的缺血再灌注损伤1 - 3。线粒体功能障碍是内部线粒体膜(IMM)的渗透性突然增加的结果,通过称为线粒体渗透转变孔(MPTP)的多蛋白质通道的持续开口1。这允许在水,离子的IMM和未调节的FL UX上进行不受控制的质子流动,并溶解于线粒体基质的高达1.5kDa。这导致内部线粒体膜电位丧失,这对于ATP生产,钙稳态破坏,线粒体肿胀和外部线粒体膜(OMM)必不可少。最终细胞以不受控制的方式开始通过坏死4.。因此,MPTP可能是维持在一系列疾病状态下进行线粒体功能和细胞死亡预防的有吸引力的靶标。

通过测定线粒体的钙保留容量(CRC)来评估MPTP开口及其抑制作用TM值-5N,低自动化膜不透水染料,其在结合钙(图1)时表现出流发射强度的增加(图1)。


将固定体积的氯化钙按规定的间隔添加到样品(线粒体悬浮液)中,每一个都会引起一个信号峰值,由于钙被线粒体基质吸收而消散。MPTP的打开会破坏线粒体膜电位,从而导致基质中积累的钙的释放,导致荧光信号突然持续增加(图2)。

材料与方法

  • 新鲜孤立的肝线粒体
  • 钙绿-5N(分子探针)
  • 氯化钙(Sigma)
  • 感兴趣的抑制剂
  • 黑色96孔微孔板(Greiner)
  • Polartar Omega(BM德赢vwin官网客服G Labtech)

实验程序
每4分钟加入每4分钟到小鼠肝线粒体的钙,在流动荧光CA的存在下2+指示器,钙绿5n。钙吸收后接着测量超线粒体钙绿色荧光,直至实现MPTP开口。在开始CA之前立即将每个抑制剂加入到线粒体中2+实验。


仪器设置

视镜设置 荧光强度,板模式动力学
筛选 励磁485
发射530.
获得1800.
常规设置 闪光数10
建立时间0.1 s
动力学设置 循环次数160
循环时间30秒
孵化 25℃
注射设置 使用智能分配
泵体积4μL
泵速300μl/ s
注射周期4.

成绩与讨论

主要是,持续的线粒体矩阵CA2+过载触发长时间的高导MPTP开路。因此,利用分离的线粒体进行CRC检测是MPTP抑制剂表型筛选的一个很好的工具。如图2所示,不同的抑制剂对MPTP开放的抑制程度不同。有希望的候选者可以用浓度依赖性的方式进行检验。如图3所示,在CRC检测中,一种铅抑制剂显示MPTP抑制呈浓度依赖性。

结论

CRC测定是一种高通量测定,用于筛选MPTP抑制剂,用偏光半球菌ω微板读卡器筛选。也可以用于活透渗透细胞的测定。由于多次喷射和短流荧光尖峰,需要一种鲁棒的微孔板读取器,该读取器检测快速敏感的流动荧光强度快速和敏感。Polar Star Omega已被证明满足这些要求。此外,微孔板读取器通过其控制软件的直观操作有助于运行这种复杂的测定。


参考

1.Bernardi P, Lisa FD(2015)线粒体通透性过渡孔:分子性质和作为心脏保护的靶点的作用。j·摩尔。细胞。心功能杂志。78年,100 - 106。
2. Rao VK,Carlson EA,Yan SS(2014)线粒体渗透性过渡孔是神经变性的潜在药物靶标。Biochim。Biophys。Acta,1842,1267-72。
3.Mukherjee R等人(2016)胰腺线粒体通透性过渡孔诱导和损伤的机制:抑制通过保护ATP的产生来预防急性胰腺炎。65年肠道,1333 - 46。
4. Nakagawa T等人。(2005)细胞素D依赖性线粒体渗透性转变调节一些坏死但不凋亡的细胞死亡。自然434,652-8。

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