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基于细胞的检测方法检测城市污水处理厂出水中残留的β阻断物质

K.Bernhard C. Stahl R.Martens M.Frey Siz Zellkulturtechnik,C / O Hochschule Mannheim,Mannheim,德国 03/2018
  • 体外CAMP依赖的测定通过动作模式测量β-ocketers
  • 污水处理厂废水中残留药物的检测
  • Clariostar.®微孔板读卡器可以实现基于FRET的CAMP传感器的动力井扫描

介绍

人类药物的残留物,例如β-窝囊及其代谢物,越来越多地发现在欧洲的治疗植物(WWTP)的EF流动废水中。β-障碍物拮抗β-肾上腺素能受体,从而控制高血压和心律失常。靶向β1-肾上腺素能受体的氨基酸序列在脊椎动物中进化高度保守。因此,它似乎有可能表达与人β1-肾上腺素能受体相似的蛋白质的生物,在暴露时也会生理学上对β-受体阻滞剂。对于风险评估,必须知道水生生物的程度暴露于β-嵌体以及具有相同作用方式(MOA)的代谢物。因此,我们开发并验证了基于细胞的MOA测定,通过该基于细胞的MOA测定,通过该基于细胞的MOA测定,可以评估富含固相萃取(SPE)的废水样品中的β-嵌体活性。随着我们的测定,我们能够测量废水EF FOL的总β-嵌体作为铅物质甲酚(Meteq)的等同物。


测定原则

材料与方法

  • CHO细胞(DSMZ-NO。ACC-110)
  • 微孔板(96孔,黑底,Nunc)
  • 美容(西格玛)
  • 异丙肾上醇(Sigma)
  • 质粒(Siz Zellkulturtechnik Mannheim)
  • Clariostar.®微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服

实验程序
使用Fugene-HD(Promega)将Cho细胞转染遗传编码的FL助长Cepac(CAMP检测FRET Biosensor Merululan-EPCREN - EPAC(Exchange蛋白)阵营阵营阵营传感器。转染后24h,选择细胞并在G418下膨胀。将得到的Cepac混合细胞克隆与人β1-肾上腺素能受体基因超过期。转染后24h,选择细胞并在G418和潮霉素下膨胀。在诱导转基因表达通过从培养基中取出的转基因表达时,使用激动剂异丙肾上腺素筛选亚邻肾上腺素能受体活性:受体激活时,细胞内CAMP水平增加(图1),因此排放流动比470nm / 535nm增加在420nm激发时(图2)。

在β-阻滞剂存在下,产生较少的阵营,导致470/535比的浓度依赖性降低。Cepac-β1-肾上腺素能受体传感器细胞系用于测定废水样品中的β-嵌体的活性。测量用Clariostar Microplate Reader(BMG Labtech)进行。德赢vwin官网客服在氟洛尔洛尔等当量(Meteq)中测量活动。


仪器设置

视镜设置 荧光强度,扫描
顶级光学
多合理数量 2
单色仪设置 天蓝色的
激励:420-15
二向西:443.8
排放:470-20
获得:2100
茶晶
激励:420-15
二向西:476.2.
排放:535-20.
收益:2200
焦的高度 4.9毫米
好扫描 矩阵扫描

尺寸:4x4 mm

直径:2毫米

动态设置(脚本向导) 不。每个点的闪光 8
周期数 17.
周期 195秒
注射 注射时间 第四周期
注射体积 25μl.
泵速度 430µl / s

成绩与讨论

使用表达β1-肾上腺素能受体和CEPAC的CHO细胞,在富集的样品中的复杂混合物如WWTP EF FL uents中测量β-嵌体活性(图3)。

用铅物质美托洛尔验证了该方法。检测废水样品的β-阻断剂浓度为4.2µg/l MetEQ(图4),化学分析(LC-MS/MS)测定的美托洛尔浓度为1.2µg/l。美托洛尔活性越高体外与化学分析测定的美托洛尔浓度相比较,可以解释为存在进一步的β阻断剂。对选定的药物化合物的化学分析确定了废水样品中还有其他的β阻断剂,如比索洛尔、普萘洛尔和阿替洛尔(TZW Karlsruhe,数据未显示)。


结论

在活细胞中基于MOA的β-嵌体测定在复杂混合物中的总β-嵌体活性测量诸如WWTP EF FLONES中作为铅物质甲酚(Meteq)的等同物。该测定适用于在大规模监测的标准方法和常规就业中,它们被排放到的水生环境。ClarioStar Microplate Reader支持这一点德赢Vwin安全吗,因为它提供了高度稳定和可靠的结果以及连续使用所需的稳健性。

参考

伯恩哈德等人。(2017)两种新型实时细胞的分析量化了β阻滞剂和NSAID规范在城市废水处理厂的EF FOLS中的效果,水资源研究Vol。115,PP。74-83,2017年5月15日。

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