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基于细胞的测定检测城市废水处理厂排出物中的残留β-嵌体物质

K. Bernhard C. Stahl R. Martens M. Frey 德国,曼海姆,曼海姆高等学校 03/2018
  • 在体外camp依赖测定法通过作用方式测定β受体阻滞剂
  • 污水处理厂的残留药物检测EF液体
  • CLARIOstar®微孔板阅读器能够很好地动态扫描基于fret的cAMP传感器

表的内容

介绍

人类药物的残留物,如β受体阻滞剂及其代谢物,在欧洲各地的污水处理厂(WWTP)的废水中发现的越来越多。β受体阻滞剂可拮抗β肾上腺素能受体,从而控制高血压和心律失常。在脊椎动物中,β1肾上腺素能受体的氨基酸序列在进化上是高度保守的。因此,很可能生物体表达了一种与人类β1肾上腺素能受体功能相似的蛋白,在暴露时也会对β受体阻滞剂产生生理反应。为了进行风险评估,人们必须知道水生生物暴露于β受体阻滞剂以及具有相同作用模式的代谢物(MOA)的程度。因此,我们开发并验证了一种基于细胞的moa检测方法,通过固相萃取(SPE)富集的废水样品中的总β阻断剂活性可以被评估。通过我们的检测,我们可以测量废水中总β阻滞剂活性,相当于铅物质美托洛尔(MetEQ)。


测定原理

材料与方法

  • (DSMZ-No CHO细胞。acc - 110)
  • 微孔板(96孔,黑底,NUNC)
  • 美托洛尔(σ)
  • 异丙肾上腺素(σ)
  • 质粒(SIZ Zellkulturtechnik Mannheim)
  • CLARIOstar®microplate阅读器(BMG L德赢vwin官网客服ABTECH)

实验的程序
用FUGENE-HD (Promega)基因编码的荧光荧光CEPAC (cAMP检测FRET生物传感器mCerulean - Epac (cAMP直接激活交换蛋白)- mCitrine) cAMP FRET传感器转染CHO细胞。转染24h后,选择细胞在G418下扩增。用人β1肾上腺素能受体基因超转染得到的CEPAC混合细胞克隆。转染24h后,选择细胞在G418和潮霉素作用下扩增。从培养基中提取多西环素诱导转基因表达后,使用激动剂异丙肾上腺素筛选亚克隆的β1肾上腺素能受体活性:受体激活后,细胞内cAMP水平升高(图1),因此在420nm激发时,470nm/535nm发射荧光比升高(图2)。

在β受体阻滞剂存在的情况下,更少的cAMP产生导致470/535比率的浓度依赖性降低。用CEPAC-β1肾上腺素能受体传感器细胞系测定废水样品中的β阻断剂活性。使用CLARIOstar microplate reader (BMG Labtech)进行测量。德赢vwin官网客服用美托洛尔当量(MetEQ)测定活性。


仪器的设置

光学设置 荧光强度,扫描
前视
不。的multichromatics 2
单色仪的设置 蔚蓝的
激励:420 - 15所示
二向色:443.8
排放:470 - 20
收益:2100.
黄水晶
激励:420 - 15所示
二向色:476.2
排放:535 - 20
获得:2200
焦点 4.9毫米
扫描 矩阵扫描

尺寸:4 x4毫米

直径:2毫米

动态设置(脚本向导) 每点闪光数量 8.
不。的周期 17
周期时间 195年代
注射 注射时间 第四周期
注入量 25µL
泵速 430μl/ s

结果与讨论

使用表达β1肾上腺素能受体和CEPAC的CHO细胞,在复杂混合物中测量β阻断剂活性,如在富集spe样品中的污水处理厂废水(图3)。

测定用铅物质氟托洛尔验证。发现测定废水样品的β-嵌体浓度为4.2μg/ L meteq(图4)。通过化学分析(LC-MS / MS)确定的相应的富含托洛尔浓度为1.2μg/升。较高的富含托洛尔活性测量在体外通过另外的β-嵌体来解释通过化学分析确定的氟洛尔醇浓度比较的测定。所选药物化合物的化学分析确定了废水样品(TZW Karlsruhe,数据未显示的数据)中等双子润醇,普萘洛尔和阿替洛尔等β-嵌体。


结论

活细胞中基于moa的β阻断剂测定法测量复杂混合物中的总β阻断剂活性,如作为铅物质美托洛尔(MetEQ)的等效物的污水处理厂废水。该方法可作为一种标准方法和常规方法,用于大规模监测污水处理厂废水及其排放的水环境。CLARIOstar微孔板阅读器支持这一点,因为它提供了高度稳定和德赢Vwin安全吗可靠的结果,以及持续使用所需的稳健性。

参考文献

1.Bernhard等人(2017),两种基于细胞的新型实时检测方法量化了β受体阻阻剂和非甾体抗炎药在城市污水处理厂废水中的特定效应,《水研究》第115卷,74-83页,2017年5月15日。

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