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基于细胞的测定检测城市废水处理流出物中的残余非甾体抗炎药(NSAID)

K.Bernhard C. Stahl R.Martens M.Frey 德国曼海姆大学文化技术研究所SIZ Zellkulturtechnik 06/2018
  • 体外以作用模式为基础的检测方法通过其cox抑制功能检测非甾体抗炎药
  • 污水处理厂的残留药物检测EF液体
  • CLARIOstar®微孔板读取器使用LVF单色仪测量比率探头TM值

介绍

人类药物的残留物,如NSAIDs和它们的代谢物,越来越多地发现在欧洲的城市废水处理厂(WWTP)的EF FOL。NSAIDS通过抑制环氧氢基团(COX)来减少疼痛和氨爆炸,从而产生前列腺素,例如前列腺素。NSAID靶向的COX的氨基酸序列在脊椎动物中进化地高度保守。因此,表达COX的生物似乎也可能在暴露于它们时生理学上对NSAID进行响应。对于风险评估,必须知道水生生物的程度暴露于NSAIDs以及具有相同行动模式的代谢物。因此,我们开发并验证了一种基于细胞的动作模式(MOA)测定,通过其固相萃取(SPE)富集的废水样品中的总NSAID活性可以测量为铅物质Diclofenac(Diceq)的等同物)。


测定原则

材料与方法

  • CHO细胞(DSMZ-NO。ACC-110)
  • 微孔板(96孔,黑色底部,Greiner)
  • 双氯芬饼(Cayman Chemical Company)
  • 花生酸(Sigma)
  • 质粒(SIZ Zellkulturtechnik mann)
  • www.v66088.com 微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服

实验程序
使用Fugene-HD(Promega),用遗传编码的Fl荧光氧化还原传感器谷酮氧化嗪 - (GRX-)rogfp3和COX1进行COP细胞。在选择G418和潮霉素时,将细胞膨胀,亚克隆并筛选COX1活性1。氧化还原传感器Grx-roGFP3的cox - 1依赖性氧化增加了激发荧光比395nm/ 485nm,而非甾体抗炎药浓度依赖性抑制了荧光比的增加。使用Grx-roGFP3-COX1传感器细胞系检测废水样品中的NSAID活性。使用CLARIOstar平板阅读器进行测量,设置如下。用双氯芬酸当量(DicEQ)测定活性。


仪器的设置

视镜设置 荧光强度,井模式动力学
顶级光学
多元组织数量 2
单色仪设置 氧化的罗格布
激励:395-15
二向西:460.2
排放:528-20.
获得:2500
被引导的Rogfp.
激励:485-15
二向西:505.2.
排放:528-20.
收益:1800
焦点 4.7毫米
扫描 轨道平均 直径:4毫米
动力学设置 不。的闪光 20.
间隔数量 3(动力学窗口1)
25(动力窗2)
间隔时间 5 S.
注射 注射时间 在第4周期之后
注射体积 40μl.
泵速度 430μl/ s
注射后摇晃 每秒300转,双轨道

成绩与讨论

将RogFP3和COX1表达的细胞暴露于WWTP EF FL型的rogFP率为COX1抑制的结果(图3)。

通过已知量的铅物质标准双氯芬酸验证测定。发现测定废水样品的NSAID活性为3.5μg/ L骰子(图4)。通过化学分析(LC-MS / MS)确定的相应的双氯芬酸浓度为2.2μg/ L(TZW Karlsruhe,数据未显示)。由此测量的较高的NSAID活动在体外通过进一步NSAID的存在解释了由化学分析确定的双氯芬酸浓度的测定。所选药物化合物的化学分析在废水样品中确定了含有布洛芬和萘普生的另外的NSAIDS(TZW Karlsruhe,数据未显示)。

结论

活细胞中的基于MOA的NSAID测定允许测量复杂混合物中的总NSAID活性,例如WWTP EF FOL,作为铅物质Diclofenac(Diceq)的等同物。在WWTP EF FL UNT中存在的其他NSAID抑制了COX1,如化学分析所固定的。该测定可以设计为标准方法,其中常规就业潜力在大规模监测WWTP EF FOL的情况下,它们被排入的水生环境。Clariostar.多模微孔板读卡器可靠地使用其独特检测了比率rogfp探针LVF单色器TM值。它对记录流动谱的灵活性支持NSAID测定的开发。德赢Vwin安全吗


参考

1.Bernhard et al. (2017) Water Research Vol. 115, pp. 74-83, 2017年5月15日。doi: 10.1016 / j.watres.2017.02.036

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