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在1536孔微孔板中测量的细胞和生物化学HTRF测定

弗兰卡·毛雷尔(1)托马斯·鲁(2)范妮Plénière(2)纳吉姆·杜伊里(2) (1) 德赢vwin官网客服BMG实验室(2)Cisbio 05/2016
  • 两个HTRF®以1536W格式进行测定和测量
  • Pherastar.®FSX为HTS和复合随访提供强大而快速的阅读
  • 新的后机匣激光测量HTRF在一个完整的1536孔微孔板36秒

介绍

筛选新的候选药物是制药行业的一个标准程序。然而,对检测和仪器的要求越来越高。特别是每天测量的样品数量应该进一步增加。如果使用高浓缩的微孔板,例如1536孔微孔板,这是可以实现的。所选择的仪器必须能够以尽可能快的读取时间测量这样的微孔板,同时应达到分析性能标准(如Z´值或S/B)。


为了满足超高通量筛选的要求,BMG实验室开发了microplate阅读器pherstar德赢vwin官网客服FSX。新的TRF激光器能够在1536孔微孔板上实现最快的读取时间。Cisbio Bioassays的两种HTRF检测被选中,以突出pherstar实现的增强性能FSX


测定原则

HTRF.®IP-One铽细胞测定是选择在培养细胞中检测肌醇1磷酸盐(IP1)水平的测定。在GQ偶联受体上的GPCR配体结合事件之后,细胞将产生IP1。该测定可用于研究GPCR激动剂和拮抗剂对GQ途径的影响。测定原理如图1所示。1。

IP1的单克隆抗体用HTRF供体标记(Lumi4™-Tb加密)。细胞内产生的IP1将与抗体结合位点的HTRF受培训型IP1竞争。具体化HTRF信号与样品中的蜂窝IP1的浓度成反比。


第二种方法检测蛋白质结合域与肽的相互作用。测定原理如图2所示。

携带HTRF供体的抗GST抗体将结合GST标记的溴琼瓜素模块(BRD4)。生物素化的组蛋白肽与HTRF受体结合。只要组蛋白肽和溴琼瓜之间存在相互作用,将被监测高HTRF信号。抑制剂,例如(+)JQ1,将防止相互作用导致HTRF信号的降低。


材料与方法

  • 来自Greiner的白色1536孔高基孔板
  • HTRF IP-ONE测定和简称TM值Cisbio的组蛋白/BRD4结合试验
  • 来自Gyger的Certus纳米液体分发器
  • Pherastar.FSX来自BMG Labtech的酶标器读卡器配有F德赢vwin官网客服L灰灯和TRF激光器

所有的细胞培养和移液步骤都符合Cisbio的建议1、2。CERTUS液体处理器用于试剂分配到1536孔微孔板中。在必要的孵育时间后,在Pherastar中读取微孔板FSX使用以下仪器设置:

检测方法: 时间分辨荧光(双发射)
光学模块:

HTRF

生灵:337.
EmissionA: 665
爆炸:620

集成开始: μ60年代
集成时间: 400μs
光源: 闪光灯或激光器
率乘数: 10000

成绩与讨论

IP-One蜂窝测定
图3显示了阿托品对IP-One水平的浓度依赖性作用。

利用后机匣激光在1闪光飞行模式下进行了测量。四参数标准曲线拟合结果为R2值为0.9994。从拟合火星数据分析软件计算IC50.值为33纳米,满足我们的期望。


Histone-BRD4-Interaction化验
已知的抑制剂(+)JQ1用于显示对组蛋白-BRD4相互作用的抑制作用(图4)。

从上图可以看出,使用PHERAstar可以在1536井格式下可靠地测量HTRF分析结果FSX。在飞行模式下使用后机匣激光进行HTRF测量将使用户在36秒内读取板,而Z´值是优秀的。从数据中我们也可以得出,与闪光灯测量相比,使用激光将导致更高的S/B值(图5)。

结论

Cisbio的HTRF技术与pherstar的结合FSX微孔板读卡器提供可靠的工具,可快速可靠的高通量筛选和复合随访。

Lumi4是Lumiphore Inc.的商标。
HTRF是Cisbio的注册商标。


参考资料

1。http://www.cisbio.com/drug-discovery/ip-one-htrf-assay-kit.
2。http://www.cisbio.com/drug-discovery/epigeneoustm-binding-domain-assays

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