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使用下一代HTS微板阅读器的细胞多巴胺和细胞内钙信号

Mark Koeppel (1) EJ Dell (2) (1) Invitrogen (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 02/2010
  • 直接光学底部读数,双发射检测和高分辨率的好扫描是微孔板阅读器的特点,大大增强了所有的细胞为基础的分析
  • Fluo-4直接™钙的测定和探戈™多巴胺受体1测定

表的内容

介绍

本申请说明突出了BMG Labtech微孔板读取器在来自Invitrogen的两种不同细胞基荧光强度测定中的直接光学底部读取性能。德赢vwin官网客服首先,使用Fluo-4 Direct™钙测定法在HEK 293细胞中测量对组胺的细胞内钙响应。先进的高分辨率细胞层扫描显示与井中的钙信号和细胞位置的相关性。其次,使用探戈™D1-BLA U2OS细胞和活细胞FRET基板(Liveblazer TM)测量通过用多巴胺(D1激动剂)的多巴胺D1受体激活多巴胺D1受体的诱捕。Liveblazer™衬底在细胞中产生的荧光信号极大地受益于Pherastar®FS.´独特的底部读双发射检测。的PHERAstarFS.是下一代高温超导微孔板读卡器,因为它有许多其他仪器没有的独特特性。对于这个应用,这些独特的特点包括:直接光学底部读数;双发射检测;在测量点注射;高分辨率井扫描(30x30矩阵);和轨道平均。


材料与方法

  • 384孔板(康宁)
  • Tango™D1-bla U2OS DA检测试剂盒(Invitrogen)
  • Fluo-4 Direct™钙测定套件(Invitrogen)
  • LiveBLAzer™-FRET B/G装载试剂盒(Invitrogen)
  • HEK293细胞

Fluo-4直接TM钙的测定
在25μl的测定培养基中,在15,000个细胞/孔中将HEK 293细胞接种到384孔微孔板中。然后将相等体积的2x Fluo-4 Direct™钙试剂加入到井中,将板在37℃的CO中温育2使用板载试剂注射器将5、10、15 μl组胺(270 nM)分别注射于不同孔内,在酶标仪上采用快速动力学(孔模式)设置记录细胞内钙通量。读数每0.5秒进行一次,持续90秒,10秒注射组胺。


使用直接光学底部读数和测定特定光学模块(EX / EM 485/520)测量荧光信号。测量钙响应后,使用10×10扫描矩阵进行底部读数,细胞层的高分辨率孔扫描。

Tango™D1-bla U2OS GPCR细胞检测方法
在32μl的测定培养基中,将Tango™D1-BLA U2OS细胞以15,000个细胞接种到384孔微孔板中。多巴胺,8μl5x浓度,(柱1-10,9重复)加入细胞中以产生剂量响应曲线,然后在CO中孵育5小时2孵化器在37°C。处理后,在室温下加入8 μl 6X LiveBLAzer™底物2小时。使用直接光底读和双发射光模块读取板,在405 nm激发,在460 nm和530 nm发射。


结果与讨论

Fluo-4直接TM钙的测定
图1显示了使用Invitrogen公司的Fluo-4 Direct™钙含量测定法在HEK 293细胞中注射三种不同体积(5、10和15 μl)的组胺(270 nM)后测定的细胞内钙反应。可以定义不同的范围,以使用这些范围执行不同的计算。当计算平均值时(插图图1),一些重复发现差异很大。

在动力学测量后,采用直接光学底部读数和10x10矩阵进行先进的高分辨率电池层井扫描。从图2中可以看出,每个井中间的单元数不同,导致信号也相应变化。

因此,井扫描可以用来帮助更正的手机号码。为了避免这种不均匀的细胞分布和结果,可以做三件事:

1)使用预涂层的微孔板,使细胞粘附更好;
2)降低注射速度,不干扰细胞层;和
3)使用轨道平均函数,测量并平均整个井的读数。

Tango™D1-bla U2OS细胞分析
Tango™division arrested U2OS cell line被用来通过arrestin募集来测量D1受体与多巴胺的活性。Tango™GPCR检测使用-内酰胺酶作为报告因子来测量受体激活。在细胞系中激活的GPCR将蛋白酶标记的抑制素招募到激活的GPCR上,GPCR将标记在受体c端的非原生转录因子裂解。释放的转录因子进入细胞核,刺激内酰胺酶的表达。-内酰胺酶测量与活细胞荧光-内酰胺酶FRET底物LiveBLAzer™。底物含有香豆素和荧光素,由-内酰胺酶底物CCF2连接。在非活性状态下,连接的香豆素和荧光素之间发生荧光共振,并在发射波长530 nm处发出绿色信号。受体激活后,细胞中表达的-内酰胺酶裂解底物,导致460纳米处蓝色信号增加。

蓝色与绿色细胞的比率用于评估受体激活,并提供了一个强大的检测,方便的高温综合征。图3显示D1受体随着多巴胺含量的增加而激活。如图3所示,随着多巴胺添加量的增加,细胞的颜色也会发生变化(从绿到蓝)。激活百分数与多巴胺浓度的对数的4个参数的匹配给出了EC50380纳米,对应于公布的400纳米。轨道平均(2mm),平均每个井的轨道多次读数,允许更好的Z值(表1),推荐用于基于细胞的分析

表1:探戈的多巴胺激活TMD1-bla U2OS细胞

Z” 电子商务50
轨道平均重力为2毫米 0.76 0.998 380海里*
无2毫米轨道平均重力 0.63 0.997 382海里

*与发表的400 nM波长的结果一致

结论

在BMG LABTECH的HTS仪器上进行Invitrogen公司的两种基于细胞的信号检测,Fluo-4 Direct™钙离子检测和Tango™-bla U2OS GPCR检测。德赢vwin官网客服

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