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化学发光测量反应性氧物种的产生

贝恩德·希普勒(1)犹他·克里斯蒂娜·希普勒(2) (1) 德赢vwin官网客服BMG实验室(2)FSU耶拿 12/2014
  • 可以检测到非常低的ROS浓度
  • ROS与芽孢浓度呈线性相关关系
  • Terbina Fi Ne Con依赖于ROS的时间和剂量依赖性抑制

表的内容

介绍

吞噬是生物体内依赖氧气的过程之一。在非特异性免疫防御过程中,戊糖磷酸途径活性显著增加,形成NADPH。NADPH的作用是减少与膜基细胞色素结合的氧。


因此,氧气需求强烈增加(呼吸爆发)。在此过程中,通过几种吞噬细胞(例如中性粒细胞,嗜酸性粒细胞和嗜碱粒细胞白细胞,巨噬细胞,巨噬细胞,将氧气转化为超氧化物阴离子,过氧化氢,单分子氧和羟C基团。这些细胞外高反应性氧物质(ROS)导致许多生物学效应,例如细菌细胞,寄生虫和肿瘤细胞的破坏,在FL Ammation中促进并调节免疫反应(图1)。

利用发光分析可以监测活性氧的产生过程。化学发光(CL)的测量具有很高的灵敏度和特异性,可以同时研究不同种类的活性氧(HO, O2, H2O2,1O2)。由于天然发光现象较弱,浓醇或鳞蜥蛋白依赖性化学发光经常用于检测生物系统中的超氧化物自由基阴离子。鲁米诺在其单价氧化形式中反应,露霉素以实际的形式反应o2。在这两种情况下,光产生取决于不稳定的内透铁氧化物或二恶英的形成,其对电子激发产品分解。该产品释放到地面状态的光子。


在本应用笔记中,我们展示了酵母中ROS生成的测量念珠菌白葡萄酒(白念珠菌使用lucigenin)。在白念珠菌,线粒体能够产生细胞外释放的ROS。研究了Terbina Fi Ne,一种被认为是自由基拦截器在ROS形成的影响。

材料与方法

使用以下念珠菌菌株进行细胞发光测量:白色假单胞菌,热带假单胞菌,吉列蒙地假单胞菌,光滑假单胞菌,侧壁假单胞菌


真菌在萨博劳葡萄糖琼脂培养基上,在青霉素和庆大霉素的存在下培养24 h。酵母悬浮液用浓度为107 ~ 1011芽孢/mL的RPMI-1640培养基或相同浓度的等张NaCl溶液配制。使用了200µL的几种酵母悬浮液。念珠菌细胞浓度为1x108将细胞/ ml用盐水在盐水中孵育1μg/ ml,10μg/ ml,100μg/ ml溶解在DMSO中的盐。在振动培养箱中在25℃下进行10分钟和60分钟的孵育。持续时间仅限于特布利纳葡萄球菌对细胞数和生长的影响。Lucigenin溶液在PBS的浓度下制备10-4mol/L,在30℃或37℃下,用注入泵加入各孔中。


仪器设置

FLUOstar / POLARstarω Clariostar. PHERAstarFS
检测模式 发光
方法 板模式动力学
视镜设置 镜头 镜头 发光光学模块
每数据测量时间 1秒
每周期测量时间 60秒
周期数 20.

样本取自不同细胞数的酵母菌株和固定细胞数、不同特比那菲ne浓度的酵母菌株。在20分钟的测量周期内,使用每分钟平均计数(cpm)进行计算。


结果与讨论

荧光素依赖性化学发光的测定结果念珠菌念珠子,念珠菌Glabrata,Candida Guilliermondii,Candida Parapsilosis,Candida Tropicalis如表1所示。


表1:不同酵母种类的比较。

念珠菌白葡萄酒 Candida Guilliermondi 假丝酵母parapsilosis 假丝酵母tropicalis Candida Glabrata. Trichosporon Capitatum.
细胞 rlu. rlu. rlu. rlu. rlu. rlu.
E + 7 /毫升 0 0 2 0 0 19.
E + 8 /毫升 0 0 4 0 7 94
E + 9 /毫升 2 12. 19. 25. 35. 101.
E + 10 /毫升 30. 48. 61. 90 126. 124.
E + 11 / ml 64. 122. 156. 102. 189 324.
r = 0.91
P = 0.02
r = 0.96
P = 0.01.
r = 0.960
p = 0.009
r = 0.74
p = 0.10
r = 0.84
P = 0.07
r = 0.970
p = 0.004

(rpmi-培养基,T = 30°C,Lucigenin-溶液100μl)

值得注意的是,产生反应性氧气白念珠菌浓度为10时检测不到7到109胚胎孢子/ ml。在≥1010bortosporles/ ml下测量侦测的Cl值。结果可以通过测定变化和相对光单元(RLU)的浓度和相对光单元(R = 0.91)的线性相关性(R = 0.91)和相对光单元(RLU)的线性相关性(R = 0.91)的再现性。由于计算的相关性COF FIE纤维,ROS生成和胚泡孔浓度的线性和直接比例可以被配置。通过测定变化几天(未显示数据),通过测定变异的结果证明了结果的再现性。与Terbina Fi Ne孵育10分钟后,已经看到了对ROS产生的剂量依赖性抑制(图2)。

DMSO本身作为可溶性试剂,揭示了抗氧化性能。然而,对ROS产生的抑制性显着依赖于使用的特布尔比纳浓度。在Terbina Fi Ne浓度为1μg/ ml(t1),抑制物相当于9.4%和100μg/ ml(t100)至24%。


与DMSO培养的对照和特比萘芬最高浓度(100µg/ml (T100))比较,抑制作用显著(p<0.05)。与特比萘芬孵育60分钟后,抑制放大(数据未显示)。1µg/mL特比萘芬(T1)的抑制率为18%,100µg/mL特比萘芬(T100)的抑制率为41.1%。特比萘芬浓度为10µg/mL (T10)和100µg/mL (T100)时效果显著(p < 0.05)。剂量为10µg/mL(1%)对应于外用制剂的剂量。


结论

各种念珠菌酵母和芽孢菌产生ROS的能力可以通过依赖荧光素的化学发光来监测。在没有任何刺激的情况下,CL方法可以检测到几种真菌产生的非常低的ROS浓度。


这是用来寻找特比萘芬对白念珠菌ROS形成的影响。结果证实特比萘芬对活性氧产生的抑制作用是时间和剂量依赖性的白念珠菌。由于时间依赖性,Terbina可能不仅具有激进的清除性质,而且还与产生反应性氧物种的途径相互作用。总之,Terbina Fi Ne降低了能力白念珠菌产生反应性氧。

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