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Cisbio的HTRF皮质醇测定在Pherastar FS上进行

Jean-Luc Tardieu Francois Degorce Cisbio. 03/2007
  • 11β-羟基甾醇脱氢酶1(11 beta-HSD1)是日常代谢中的关键酶
  • Cisbio的皮质醇测定在Pherastar上进行®FS.确定11 beta-hsd1活动
  • EC.50.皮质醇和IC的值50.常见抑制剂的值确定

介绍

皮质醇是一种在许多代谢过程中存在的皮质类固醇激素,诱导碳水化合物,脂肪和蛋白质代谢的关键酶。皮质醇还可作为抗炎和免疫抑制剂。创造这种重要激素的一种方法是通过NADPH所依赖的11β-羟类脱氢酶1(11β-HSD1)来减少可可变酮。该酶可以在几种组织中发现,但它主要存在于肝脏和脂肪细胞中。


最近Cisbio开发了一种测定,以使用HTRF确定11个Beta-HSD1的活动®技术。HTRF.®(均相分辨荧光)基于TR - FRET(时间分辨荧光共振能量转移),FRET化学的组合和使用具有长发射半流的荧光团(铕,欧洲3+)。FRET使用两个荧光团,捐赠者和受体。如果它们在给予彼此的给定接近,能量源(例如闪光灯或激光)通过能量源(例如闪光灯或激光)的激发触发能量转移到受体。接受者反过来发射给定波长的光。

测定原则

皮质醇测定是一种基于单克隆抗体的竞争性测定(图1)。它分两步运行。结束脱氢酶反应后(刺激步骤),将抗皮质醇加密(供体)和D2标记的皮质醇(受体)加入到反应混合物中。抗皮质醇密码和D2标记的皮质醇将彼此束缚,导致高HTRF®信号。在酶反应过程中建造的皮质醇将与D2标记的皮质醇竞争,用于与加密缀合物的结合,导致HTRF的损失®信号(检测步骤)。

材料与方法

仪器
德赢vwin官网客服BMG Labtech的PherastarFS.,芬培堡,德国HTRF®光学模块(激发:337nm,排放A:665 NM和发射B:620nm),德国欧洲堡联尼亚的HTRF®皮质醇测定Bagnols,法国。


皮质醇标准曲线

10μL皮质醇标准(连续稀释)和每个HTRF的5μl®将缀合物(抗皮质醇加密和皮质醇-D2)从Greiner分配到黑色384小体积微孔板的孔中。使用HTRF测量板®模块两小时后孵育16小时。


生物化学测定
抑制剂剂量响应曲线2μl11beta-hsd1微粒体制剂(0.1mg / ml)在TRIS 20mM EDTA 5mM缓冲液(pH = 6),6μl的TRIS 20mm,EDTA 5mM缓冲液(pH = 6)含有可可子将在Tris 20mM EDTA 5mM缓冲液中不同浓度的266nm和NADPH333μm和2μl抑制剂(碳氧酮和甘草酮)分配到孔中。在37℃下孵育2小时后,每个HTRF的5μl®加入缀合物(抗皮质醇加密和皮质醇-D2)。在仔细阅读之前在室温下将板在室温下孵育2小时FS.

数据分析
该信号以ΔIO%(DF%)表示。

其中比率=(665nm /信号在620nm处的信号)x 104和pos.control =正控制和neg.control =负控制。


该比率由Pherastar自动计算FS.火星数据分析软件。


成绩与讨论

图2显示了不同孵育时间的皮质醇滴定曲线。

该数据表明,随着皮质醇浓度的增加,抗皮质醇加密ate比例地移位,导致信号曲线降低。


表1:EC50.不同孵化时间后皮质醇标准曲线的值。

抑制剂 我知道了50.μm
Carbenoxolone. 1.03
甘草酸 1.17

结论

皮质醇测定允许快速有效地测定复合样品中的皮质醇,例如血清和全细胞。对于活性11β-羟基甾醇脱氢酶1和其抑制剂的筛选也使用该均匀测定来简单且有效。


Pherastar.FS.结合优化的HTRF®光学模块是运行HTRF的理想工具®测定。Pherastar.FS.光学设计在荧光和发光测定中提供出色的敏感性和准确性;此外,双同时测量最小化了测定的读取时间。

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