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西斯比奥的HTRF皮质醇测试在PHERAstar FS上进行

Jean-Luc Tardieu Francois Degorce Cisbio 03/2007
  • 11β-羟基甾醇脱氢酶1(11 beta-HSD1)是日常代谢中的关键酶
  • Cisbio的皮质醇测定在Pherastar上进行®FS.确定11 beta-hsd1活动
  • EC.50.皮质醇和IC值50.常见抑制剂的值确定

介绍

皮质醇是一种在许多代谢过程中存在的皮质类固醇激素,诱导碳水化合物,脂肪和蛋白质代谢的关键酶。皮质醇还可作为抗炎和免疫抑制剂。创造这种重要激素的一种方法是通过NADPH所依赖的11β-羟类脱氢酶1(11β-HSD1)来减少可可变酮。该酶可以在几种组织中发现,但它主要存在于肝脏和脂肪细胞中。


最近Cisbio开发了一种使用HTRF测定11 β - hsd1活性的方法®技术。HTRF.®(均相时间分辨荧光)以TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)为基础,FRET化学和使用具有长发射半衰期的荧光团(铕,Eu3+)。FRET使用两个荧光团,捐赠者和受体。如果它们在给予彼此的给定接近,能量源(例如闪光灯或激光)通过能量源(例如闪光灯或激光)的激发触发能量转移到受体。接受者反过来发射给定波长的光。

测定原则

皮质醇测定是一种基于单克隆抗体的竞争性测定(图1)。它分两步运行。结束脱氢酶反应后(刺激步骤),将抗皮质醇加密(供体)和D2标记的皮质醇(受体)加入到反应混合物中。抗皮质醇密码和D2标记的皮质醇将彼此束缚,导致高HTRF®信号。在酶反应过程中建造的皮质醇将与D2标记的皮质醇竞争,用于与加密缀合物的结合,导致HTRF的损失®信号(检测步骤)。

材料与方法

仪器
德赢vwin官网客服BMG LABTECH的PHERAstarFS.,芬培堡,德国HTRF®光学模块(激发:337nm,排放A:665 NM和发射B:620nm),德国欧洲堡联尼亚的HTRF®皮质醇测定Bagnols,法国。


皮质醇标准曲线

皮质醇标准品(连续稀释)10 μL,每个HTRF各5 μL®将缀合物(抗皮质醇加密和皮质醇-D2)从Greiner分配到黑色384小体积微孔板的孔中。使用HTRF测量板®两小时和十六小时的孵化后


生物化学测定
抑制剂剂量反应曲线2μL (11 beta-hsd1微粒体准备(0.1毫克/毫升)三羟甲基氨基甲烷20毫米EDTA 5毫米缓冲液(pH = 6), 6μL三20毫米,EDTA 5毫米缓冲区(pH = 6)含可的松266 nM和NADPH 333μM和2μL抑制剂(生胃酮和甘草次酸)在不同浓度三20毫米EDTA 5毫米缓冲区被分发到井。37℃孵育2小时后,每个HTRF各加5 μL®加入缀合物(抗皮质醇加密和皮质醇-D2)。在仔细阅读之前在室温下将板在室温下孵育2小时FS.

数据分析
信号用DeltaF表示为% (DF%)。

其中Ratio = (665nm信号/ 620nm信号)x 104, pos.control =阳性对照和阴性对照。对照=阴性对照。


比率是自动计算的pherstarFS.火星数据分析软件。


成绩与讨论

图2显示了不同孵育时间的皮质醇滴定曲线。

这一数据表明,随着皮质醇浓度的增加,反皮质醇密码物按比例移位,导致信号曲线下降。


表1:EC50.不同孵化时间后皮质醇标准曲线的值。

抑制剂 集成电路50.μm
生胃酮 1.03
甘草次酸 1.17

结论

皮质醇测定允许快速有效地测定复合样品中的皮质醇,例如血清和全细胞。对于活性11β-羟基甾醇脱氢酶1和其抑制剂的筛选也使用该均匀测定来简单且有效。


Pherastar.FS.结合优化的HTRF®光模块是运行HTRF的理想工具®化验。Pherastar.FS.光学设计在荧光和发光测定中提供出色的敏感性和准确性;此外,双同时测量最小化了测定的读取时间。

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