339

CLARIOstar采用基于荧光的检测方法,测定苔藓产生的人类酸性α -葡萄糖苷酶(GAA)的活性

Birgit Berg (1) Anita Fischer (1) Fabian Hässler (1) Paulina Dabrowska-Schlepp (1) Franka Maurer (2) Stefanie Tintelnot (2) (2) BMG LABTECH GmbH, Ortenberg,德国德赢vwin官网客服 08/2019
  • moss- gaa -重组表达人α -葡萄糖苷酶的活性。金属盘
  • 基于微孔板的检测方法可以与上市的α -葡萄糖苷酶进行比较
  • CLARIOstar支德赢Vwin安全吗持苔藓培养样品的分析优化和快速酶定量

表的内容

介绍

溶酶体酶酸-葡萄糖苷酶(GAA, Uniprot: P10253)是一种水解酶,负责将溶酶体糖原降解为葡萄糖。遗传性GAA缺陷被称为庞贝病。患有这种疾病的患者在各种身体组织中积累糖原,特别是在骨骼和呼吸肌中。目前,Myozyme®和少清®(SANO FEGZYME) - 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的人ALFA葡糖苷酶的重组形式是唯一用于POPPE疾病的批准治疗方法。


Moss-Gaa是在苔藓Physcomitrella的人类Gaa的替代重组版本的人类Gaa。这种专有的表达系统从优点中提供优点,例如:消除了通过动物群病原体污染的风险,并且易于操纵糖基化途径。另外,苔藓制作的蛋白质表现出高度均匀的糖基化学术,其可以是终身吸收的溶酶体酶,例如GaA的好处。


产生GAA的苔藓菌株在发光的生物反应器中培养,并将苔藓-GAA分泌到培养上清中。为了测量活性和量化培养样品中重组产生的酶,我们在96孔板格式中建立了一种已知的基于荧光的活性测定,优化了其性能,并进行了测定资格和初始验证。


测定原理

基于荧光的酶活性测定使用4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranosid已被广泛用于不同类型样品中GAA浓度和活性的测量。在本试验中,GAA水解底物释放可荧光测定的4-甲基伞形睾酮。我们使用CHO-GAA-Myozyme®作为测定开发,优化及其质量的标准。随后,开发的测定适应(对可能的基质效应的检查),用于源自苔藓栽培的培养介质样品。

材料与方法

  • www.v66088.com ®microplate阅读器(BMG L德赢vwin官网客服ABTECH)
  • 4-甲基伞形苷α d -吡喃葡萄糖苷(Roth)
  • CHO-GAA-Myozyme®(赛诺菲Genzyme)
  • 牛血清白蛋白(Sigma)
  • 黑色平底96孔microplates (Roth)摇瓶Titramax 1000 (Heidolph)
  • 孵化器(粘合剂)

实验的程序
将20µL GAA含量的样品与80µL含量为0.25 mM 4-MU α - d -吡喃葡萄糖苷的缓冲液(56 mM柠檬酸、88 mM Na2HPO4、0.4% BSA、pH 4.4)孵育在96孔的黑色微孔板上。900 rpm搅拌10秒,盖上胶粘剂微孔板密封,37℃避光孵育60分钟。加入200µL的停止液(0.1 M甘氨酸,0.1 M NaOH)停止反应,荧光测定如下图所示。


仪器的设置

视镜设置 荧光强度、端点
单色仪

励磁360 - 20

二向西:汽车402,5

排放450-30.

通用设置 数量的闪光 每口井的40
沉淀时间 0.2秒

结果与讨论

线性

校准曲线拟合是测定性能的关键组成部分。我们通过比较39 06 - 4000 ng/mL范围内已知浓度的CHO-GAA的回收率,评估了线性回归和4PL函数对曲线拟合质量的影响。采用4-PL拟合法对标定曲线进行了较好的拟合,在整个工作范围内回收率在100% - 120%之间。4-PL拟合法被选为该方法的校准功能。

2.灵敏度(定量限)


定量限(LOQ)的评估是基于整个浓度范围内CHO-GAA峰的CV%。在31 ~ 39 ng/mL之间,CV%高于10%。这个结果与传统的信噪比为1:10(用空白的平均吸光度+空白的10xSD进行插值)的值相对应,得到36 ng/mL。定量限设置为36 ng/mL。


3.精度


通过分析三个不同稀释度的CHO-GAA样品(每个样品2稀释度,每种稀释度重复3次)来评估分析内的精度,涵盖相关的工作范围。法内精密度%CV≤5%。为了估计测定间的精度,相应的样品在接下来的实验中测量,在不同的一天,由另一个操作员进行。测定了%CV≤8%的化验间精密度。

表1:GAA分析的精密度

Intra-assay精度
CHO-GAA [NG / ML] 迪勒。因素 的意思是 SD. CV %
5000 10. 4734 79. 175年,54 4%
5
2500 10. 2354年01 31,32 1%
5
1250 10. 1267年,94年 59岁的38 5%
5
Inter-assay精度
CHO-GAA [NG / ML] 迪勒。因素 的意思是 SD. CV %
5000 10. 5045,29 359年,80年 7%
5
2500 10. 2501年,84年 157,43 6%
5
1250 10. 1362年,98年 1135,51 8%

4.特定的酶活性

随后使用所述测定法测量不同GaA制剂的特定酶活性。对于这种具有4-甲基umb蛋白的标准曲线已包含在微孔板布局中。重组GaA版本的规格活性:已经测量了CHO-GAA和MOSS-GAA,显示了两种酶的相当值。


表2:市售GAA与苔藓产品的比酶活性比较(n=4)

具体活动(µ摩尔/毫克/分钟)
rhgaa. 的意思是 SD. CV %
CHO-GAA 9, 9 1、5 15,1.
Moss-GAA 9、8 1、4 13日,9

结论

本申请说明介绍了96个孔板中酸性α-葡糖苷酶的FL型酶活性测定的适应,优化和Quali。基于微孔板的形式可以在多个过程中的多种过程中快速和同时同时进行磁性GAA浓度的含量。分析测定参数:线性,灵敏度和精度展示了预期测定使用的令人满意的范围。

基于LITER的微孔板读卡器www.v66088.com 来自BMG德赢vwin官网客服 Labtech提供易于使用的仪器,可快速准确地测量该流动测量的测定。此外,互补的火星分析软件模块对评估和分析测定结果非常有用。

去前