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Clariostar在基于FOorescent的测定中确定苔藓产生的人酸α-葡糖苷酶(GaA)的活性

Birgit Berg(1)Anita Fischer(1)FabianHässler(1)Paulina Dabrowska-Schlepp(1)弗兰卡Maurer(2)Stefanie Tintelnot(2) (1)Greenovation Biotech GmbH,德国*(2)BMG Labte德赢vwin官网客服ch GmbH,Ortenberg,德国 08/2019
  • 苔藓-GaA的酶活性 - 重组在苔藓中表达人α-葡糖苷酶。pat
  • 基于微孔板的测定使得能够与销售的α-葡糖苷酶进行比较
  • Clariostar支德赢Vwin安全吗持来自青苔栽培的样品中的测定优化和快速酶量化

介绍

溶酶体酶酸α-葡糖苷酶(Gaa,Uniprot:P10253)是负责溶酶体糖原葡萄糖的水解酶。Gaa的遗传继承的效率称为Pompe疾病。患有这种疾病的患者积累了各种身体组织中的糖原 - 尤其是骨骼和呼吸肌肉。目前,yryozyme.®和少清®(SANO FEGZYME) - 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的人ALFA葡糖苷酶的重组形式是唯一用于POPPE疾病的批准治疗方法。


Moss-Gaa是在苔藓Physcomitrella的人类Gaa的替代重组版本的人类Gaa。这种专有的表达系统从优点中提供优点,例如:消除了通过动物群病原体污染的风险,并且易于操纵糖基化途径。另外,苔藓制作的蛋白质表现出高度均匀的糖基化学术,其可以是终身吸收的溶酶体酶,例如GaA的好处。


产生苔藓菌株的Gaa在被阐明的生物反应器中培养并分泌苔藓-Gaa进入培养上清液。为了测量活性并量化培养样品中的重组产生的酶,我们以96孔板形式建立了已知的流动性活性测定,优化了其性能并进行了测定Quali Fi阳离子和初始验证。


测定原则

使用4-甲基umbellifryL-α-D-吡喃葡萄糖苷的荧光基酶活性测定已被广泛用于测量GaA浓度和不同类型样品的活性。在该测定中,Gaa水解基材以释放4-甲基纤维素,其可以测量。我们使用Cho-Gaa-myozyme®作为测定开发,优化及其质量的标准。随后,开发的测定适应(对可能的基质效应的检查),用于源自苔藓栽培的培养介质样品。

材料与方法

  • www.v66088.com ®微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服
  • 4-甲基umb蛋白αD-吡喃葡萄糖苷(罗斯)
  • Cho-Gaa-myozyme®(Sano Fezyme)
  • 牛血清白蛋白(Sigma)
  • 黑色底部的96孔微孔板(罗斯)摇刺刺司刺刺刀1000(Heidolph)
  • 孵化器(粘合剂)

实验程序
将20μL含Gaa含Gaa样品(56mM柠檬酸,88mM Na 2 HPO 4,0.4%BSA,pH 4.4)孵育在黑色96孔微孔板中的0.25mm 4-muα-D-吡喃吡喃糖苷。将板搅拌10秒。在900 rpm,覆盖有粘合微孔板密封,并在37℃下孵育60分钟。通过加入200μl止乳溶液(0.1M甘氨酸,0.1M NaOH)并如下符号测量反应。


仪器设置

视镜设置 荧光强度,终点
单色仪

激励360-20.

二向西:汽车402,5

排放450-30.

常规设置 闪光数量 每孔40.
建立时间 0.2 S.

成绩与讨论

线性

校准曲线Fi ToTing是测定性能的关键组分。通过比较已知量的CHO-Gaa的回收率,评估了曲线的质量的线性回归和4pl函数,以便在39,06-4000ng / ml范围内。根据视觉评估的基于视觉评估以及在整个工作范围内的可视评估以及在整个工作范围内的更好的恢复率,通过4-PLF T,可以选择校准曲线,以4-PLFT为基础的校准曲线,选择作为测定的校准功能。

2.敏感度(LOQ)


已经基于在整个浓度范围内的CHO-GAA峰值的CV%来评估定量限制(LOQ)。CV%在31和39ng / ml之间的10%高于10%。该结果对应于基于常规信噪比的值1:10(从坯料+ 10xSD的平均吸光度插值),其计算为36ng / ml。测定的LOQ设定为36 ng / ml。


3.精确


通过在各自的稀释液中分析三种CHO-GAA样品(每个样品2稀释液,每次稀释时)来评估测定的精度,覆盖相关的工作范围。发现%CV≤5%的测定精度。为了估计分析间精确的精度相应的样本在跟随实验中测量,在不同的一天,通过另一个操作员进行。测定%CV≤8%的分析精度。

表格1:Gaa测定的精度

分析内精度
CHO-GAA [NG / ML] DIL。因素 吝啬的 SD. 简历%
5000 10. 4734 79. 175,54 4%
5.
2500 10. 2354,01 31,32 1%
5.
1250. 10. 1267,94 59,38 5%
5.
间间精度
CHO-GAA [NG / ML] DIL。因素 吝啬的 SD. 简历%
5000 10. 5045,29 359,80. 7%
5.
2500 10. 2501,84. 157,43 6%
5.
1250. 10. 1362,98 1135,51 8%

4.特定酶活性

随后使用所述测定法测量不同GaA制剂的特定酶活性。对于这种具有4-甲基umb蛋白的标准曲线已包含在微孔板布局中。重组GaA版本的规格活性:已经测量了CHO-GAA和MOSS-GAA,显示了两种酶的相当值。


表2:GAA和苔藓产品的市场形式(n = 4)之间的特定酶活性的比较(n = 4)

特定活动(μmol/ mg / min)
rhgaa. 吝啬的 SD. 简历%
CHO-GAA. 9.9 1,5 15,1.
苔藓 - Gaa. 9,8 1,4 13,9.

结论

本申请说明介绍了96个孔板中酸性α-葡糖苷酶的FL型酶活性测定的适应,优化和Quali。基于微孔板的形式可以在多个过程中的多种过程中快速和同时同时进行磁性GAA浓度的含量。分析测定参数:线性,灵敏度和精度展示了预期测定使用的令人满意的范围。

基于LITER的微孔板读卡器www.v66088.com 来自BMG德赢vwin官网客服 Labtech提供易于使用的仪器,可快速准确地测量该流动测量的测定。此外,互补的火星分析软件模块对评估和分析测定结果非常有用。

* 2020年,公司Greenovation Biotech GmbH被转变为一家新公司,ELVA GmbH。

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