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Clariostar Plus简化了其新颖的增强动态范围(EDR)技术的酶反应监测

马里奥·施耐德,珍德里克·马巴赫 德赢vwin官网客服BMG Labtech GmbH,Ortenberg,德国 02/2019
  • Clariostar.检测高变化的信号强度荧光β-半乳糖苷酶测定
  • 可以使用Clariostar量化β-半乳糖苷酶(例如:记者试验)
  • 增强的动态范围消除了增益考虑和重复优化测量

表的内容

介绍

酶的活性如何?这是生化实验室中经常讨论的问题。由于酶是生物体中发生的大多数化学反应的催化剂,它们及其调节因子往往被详细描述。


酶法测定通常采用一种底物,这种底物在酶反应过程中转化为发色团、荧光团或荧光素酶底物。这就意味着,随着反应时间的增加,信号也随之增加,直到所有底物都被酶转化。由于很难预测酶法检测的信号强度在什么范围内结束,因此检测具有挑战性,通常与寻找荧光和发光信号的正确放大倍数的各种轮有关。通过增强动态范围(EDR)特性,发现几乎无限的动态范围极大地简化了荧光和发光酶分析,并节省了设置测量的时间。

测定原理

酶β-半乳糖苷酶(β-加仑)通过分解糖苷键来催化β-半乳糖糖苷的水解。它用于生物研究,以报告细胞衰老,其由衰老相关的β-加仑表示。第二和非常流行的β-加仑的用途是报告基因:DNA构建体含有β-加仑的遗传信息和调节酶表达的促进剂。大多数情况下,β-gal用作对照基因。这意味着在瞬时转染期间与感兴趣的报告基因一起插入感兴趣的细胞中。在这种情况下,β-GAL关于转染EF效率的报告。高转染EF效率导致高酶生产;低转染EF效率导致低酶表达。表达的β-加仑的量可以用非流荧光合成β-加仑底物进行测试:荧光素DI(β-D-半乳糖醇)(FDG)。它由酶与半乳糖和流荧光分子fl uoutoncein(fitc)裂解(图1)。 Here, we measured various enzyme concentrations on the CLARIOstar使用或不使用新颖的EDR功能。

增强的动态范围(EDR)是指在一个板测量中测量非常暗淡和非常强烈的信号的技术。这样,可以覆盖8个数十年的动态范围。相反,传统测量需要通常由增益设置的信号的放大器。这限制了可以检测信号的范围(图2)。

材料与方法

  • 黑色96孔板与底部(Greiner Bio-One#655076)
  • Clariostar.
  • β牛乳糖从大肠杆菌(G6008-1KU, Sigma-Aldrich / Merck)
  • 荧光素Di-β- d半乳糖苷(F1179, Invitrogen / Thermo Fisher Scientific)

实验的程序
通过称重0.8370g kh来制备测定缓冲液24, 0.6855 g Na2HPO4·2H.2o,0.0625 TCEP和0.0203 g mgcl2·6H.2o,溶解在蒸馏水并将体积调节至50ml(坩埚最多50ml)。


将β-半乳糖苷酶溶解在1ml蒸馏水(酶储备溶液)中,将底物FL uoutcein in DI-β-D-半乳糖晶体溶于10ml水(0.5mg / ml底物缓冲液)中。标准为0.5 U / ml;0.25 U / ml;0.1 U / ml;0.05 U / ml;0.025 u / ml;通过在蒸馏水中制备双端浓度并随后在底物缓冲液中稀释1:2来制备0.01 U / mL。将底物浓度保持在0.25mg / mL的恒定。总反应体积为200μl,测量四种重复。荧光强度测量由Clariostar进行多模式孔板阅读器的设置如下所示。

仪器设置

视镜设置 荧光强度,板模式动力学
单色仪 刺激:483-14
二向西:502.5
排放:530 - 30
收益 如所示的EDR或GAIN
通用设置 数量的闪光 100.
沉淀时间 0.1秒
动态设置 周期数 28.
周期时间 600年代
温度 监控

结果与讨论

为了测试Clariostar的适用性为了测量β-gal报告基因的测定,将不同浓度的酶与合成底物FDG孵育,每10分钟测量FITC荧光来监测其转化。传统上,为了检测这样的动态测量,需要预先选择信号范围。为了演示,我们选择了一个低增益(800),它可以转换为低信号放大,应该可以防止荧光信号的过度放大。


然而,在该明智的预选范围中检测导致所有酶浓度的过度测量,因为信号增加到预期的信号(图3)。最低酶浓度显示出在反应开始后1小时10分钟的荧光增加(橙色线图3),但是由于信号超过预选强度范围,因此引出了以下时间点。通过所获取的数据不可能进行酶的量化。

测量具有EDR功能的同一板不需要任何预选。它使每个酶的浓度从最高(0.5 U/ml)到最低(0.01 U/ml)都得到了分解(图4)。因此,EDR的特性使得不需要进行第二次制备和测量。此外,它减少了运行一个工作酶分析的时间,以及开始测量时的担忧。数据进一步提供了最大转换速度和酶浓度(R²>0,99)之间的线性相关,允许定量的酶高达0.1 U/ml(数据未显示)。

结论

在这里,我们证明了主要用于报道测定的β-加仑酶测定的检测。借助Clariostar的EDR技术可以方便地监测β-gal介导荧光素的产生。它可以检测从660 RFU到3.44*10范围内的巨大信号差异8RFU。翻译成报告基因分析,这意味着可以在同一平板上测量非常高和非常低的表达。该工具简化了酶检测的设置,因为它不需要时间来考虑正确的增益设置或重复检测,直到找到最佳设置。

兼容的读者

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