330.

Clariostar Plus简化了其新颖的增强动态范围(EDR)技术的酶反应监测

Mario Schneider,Jendrik Marbach 德赢vwin官网客服BMG Labtech GmbH,Ortenberg,德国 02/2019
  • Clariostar.检测FL荧光β-半乳糖苷酶测定的高度可变信号强度
  • 可以使用Clariostar量化β-半乳糖苷酶(例如,记者分析)
  • 增强的动态范围消除了增益考虑和重复优化测量

介绍

酶有多活跃?这是生物化学实验室中经常解决的问题。作为酶的催化剂是在生物体中发生的大多数化学反应,它们及其调节剂通常详细表征。


酶促测定通常使用在酶促反应过程中转化为发色团,Fl uorophore或荧光素酶底物的基材。这意味着依次随着反应时间的增加而增加,直到所有基材由酶转化。由于难以预见的是,信号强度范围的酶法测定结束它们的检测是具有挑战性的,并且通常与各种循环的FID阳性和发光信号相关联。具有增强的动态范围(EDR)特征的几乎无限的动态范围大大简化了简单的荧光和发光酶测定,并节省了时间来设置测量。

测定原则

酶β-半乳糖苷酶(β-加仑)通过分解糖苷键来催化β-半乳糖糖苷的水解。它用于生物研究,以报告细胞衰老,其由衰老相关的β-加仑表示。第二和非常流行的β-加仑的用途是报告基因:DNA构建体含有β-加仑的遗传信息和调节酶表达的促进剂。大多数情况下,β-gal用作对照基因。这意味着在瞬时转染期间与感兴趣的报告基因一起插入感兴趣的细胞中。在这种情况下,β-GAL关于转染EF效率的报告。高转染EF效率导致高酶生产;低转染EF效率导致低酶表达。表达的β-加仑的量可以用非流荧光合成β-加仑底物进行测试:荧光素DI(β-D-半乳糖醇)(FDG)。它由酶与半乳糖和流荧光分子fl uoutoncein(fitc)裂解(图1)。 Here, we measured various enzyme concentrations on the CLARIOstar在不使用新的EDR功能。

增强的动态范围(EDR)是指在一个板测量中测量非常暗淡和非常强烈的信号的技术。这样,可以覆盖8个数十年的动态范围。相反,传统测量需要通常由增益设置的信号的放大器。这限制了可以检测信号的范围(图2)。

材料与方法

  • 黑色96孔板与底部(Greiner Bio-One#655076)
  • Clariostar.
  • β-半乳糖苷酶来自大肠杆菌(G6008-1KU,Sigma-Aldrich / Merck)
  • 荧光素Di-β-D-半乳糖醇(F1179,Invitrogen / Thermo Fisher Scienti Fi C)

实验程序
通过称重0.8370g kh来制备测定缓冲液24.,0.6855 g na2HPO.4.·2H.2o,0.0625 TCEP和0.0203 g mgcl2·6H.2o,溶解在蒸馏水并将体积调节至50ml(坩埚最多50ml)。


将β-半乳糖苷酶溶解在1ml蒸馏水(酶储备溶液)中,将底物FL uoutcein in DI-β-D-半乳糖晶体溶于10ml水(0.5mg / ml底物缓冲液)中。标准为0.5 U / ml;0.25 U / ml;0.1 U / ml;0.05 U / ml;0.025 u / ml;通过在蒸馏水中制备双端浓度并随后在底物缓冲液中稀释1:2来制备0.01 U / mL。将底物浓度保持在0.25mg / mL的恒定。总反应体积为200μl,测量四种重复。荧光强度测量由Clariostar进行多模微孔板读卡器,设置如下所示。

仪器设置

视镜设置 荧光强度,板模式动力学
单色仪 刺激:483-14
二向西:502.5
排放:530-30
收益 如所示的EDR或GAIN
常规设置 闪光数量 100.
建立时间 0.1秒
动力学设置 周期数 28.
周期 600秒
温度 被监控

成绩与讨论

为了测试Clariostar的适用性为了测量β-GAL报告器测定,将不同的酶浓度与合成底物FDG一起孵育,并通过每10分钟测量FITC FOR荧光来监测其转化。传统上,需要在前前选择的信号范围以检测这种动力学测量。对于示范目的,我们选择了低增益(800),该低增益(800)转化为低信号放大器,并且应防止增加的流量荧光信号的过度放大。


然而,在该明智的预选范围中检测导致所有酶浓度的过度测量,因为信号增加到预期的信号(图3)。最低酶浓度显示出在反应开始后1小时10分钟的荧光增加(橙色线图3),但是由于信号超过预选强度范围,因此引出了以下时间点。通过所获取的数据不可能进行酶的量化。

使用EDR功能测量相同的板不需要任何预选。它导致每种酶浓度的分辨率,从最高(0.5u / ml)到最低(0.01u / ml)(图4)。因此,EDR特征可防止需要第二次准备和测量。此外,它减少了运行工作酶测定的时间以及在开始测量时的担忧。数据进一步提供了最大转化速度和酶浓度(R 2> 0,99)之间的线性相关性,允许酶的量化至0.1u / ml(数据未示出)。

结论

在这里,我们证明了主要用于报道测定的β-加仑酶测定的检测。借助Clariostar的EDR技术β-加仑介导的Fl Uoutcein in的生产被方便地监测。它允许检测覆盖660 RFU的巨大信号差异,高达3.44 * 108.RFU。转换为记者测定,这意味着可以在相同的板上测量非常高,非常低的表达。该工具简化了酶测定的设置,因为它不需要时间思考正确的增益设置或重复测定,直到找到最佳设置。

兼容读者

去顶级