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使用BMG Labtech微孔板读卡器对皮质神经元和神经胶质细胞的肝素活性的比较德赢vwin官网客服

Sofia papadiafrédéricLéveilléGilese Hardingham 爱丁堡大学神经科学研究中心 03/2008
  • 硫昔林系统保护细胞免受H20.2- 诱导的细胞死亡
  • 使用BMG Labtech微孔板读卡器在神经元和神经胶质细胞中测量的硫氧化肽活性德赢vwin官网客服
  • 神经元的肺毒素活性比胶质细胞高3.8±0.86倍

介绍

谨慎维持细胞内氧化还原平衡是活细胞正常功能所必需的。氧化应激,或紊乱的细胞内氧化还原平衡,已与几种疾病有关,包括神经退行性疾病如阿尔茨海默病,类风湿性关节炎,急性脑血管障碍,糖尿病和癌症,并在正常老龄化中积累。在氧化应激中,增加氧化物质的产生,主要是活性氧物质(ROS),这优于细胞内在抗氧化剂防御机制中和它们的能力。由于呼吸和代谢的高水平的ROS产生,脂质过氧化易受高浓度和相对较低水平的一些抗氧化酶,如过氧化锆酶的脂质过氧化脂肪酸的存在,神经元具有高易受氧化损伤的氧化损伤。

主要的硫型抗氧化系统是谷胱甘肽(GSH)和硫醚素(TRX)还原途径。通过途径,通过NADPH,通过涉及谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和前者谷胱甘肽(GR)的一系列氧化和降低,减少过氧化氢等氧化剂含量减少了过氧化氢,并为前者的谷胱甘肽(GR)和过氧化酮(PRX) - 或后者的其他蛋白质,硫氧化肽(TRX)和硫氧嘧啶还原酶(TRXR)。GSH途径在减少小二硫化物分子和与ROS的直接相互作用方面更有效,而TRX在通过降低其暴露的二硫化物,而TRX在修复氧化的蛋白质时更有效,而其自身的活性位点半胱氨酸残基被氧化(并且通过TRXR减少)。


硫昔林系统保护细胞免受H2O.2-诱导的细胞死亡及其抑制可促进氧化应激,而过表达硫氧还蛋白的小鼠在缺血后表现出更少的氧化性脑损伤,寿命更长。


我们对神经元中硫氧还蛋白的活性及其在不同条件下的潜在变化感兴趣。然而,由于我们使用的原始皮层培养模型是神经元和胶质细胞的混合培养,我们想要确定这两种细胞类型(神经元和胶质细胞)中硫氧还蛋白活性的水平。


材料与方法

所有的材料都是通过正常的分销渠道从厂家获得的。

  • 透明的96孔板(Greiner)
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器
  • Leica DMI6000B倒摄ePif荧光显微镜

神经元培养和营养剥夺
如来自E21大鼠所述培养皮质大鼠神经元。通过在神经元培养物的一半密度下电镀大鼠皮质匀浆并在DMEM(Dulbecco的改性鹰培养基)的一半中进行培养胶质细胞,包括10%胎牛血清(Invitrogen)和抗生素(青霉素/链霉素1:100,Sigma)。与DIV4的神经元含量相比,将NO ARAC(胞嘧啶β-D-亚洲 - 呋喃硼化物,DNA合成抑制剂,Sigma)加入到胶质培养物中,与DiC4(体外4天)相反。通过在DIV7上的最小培养基(TMO)中的1mM NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸,CALBIOCHEM)中孵育在胶质培养物中杀死神经元。在8-10天的培养期后,在8-10天后,在皮质神经元发展过程中,表达功能性NMDA型和AMPA / Kainate型谷氨酸受体,并形成突触接触,在两种类型的培养物中进行了营养性剥夺。将细胞转移到缺乏营养载体的定义培养基中,以下“TMO”:10%MeM(Invitrogen),90%盐 - 葡萄糖 -德赢Vwin安全吗 甘氨酸(SGG)培养基(SGG:114mM NaHl,0.219%NaHCO 3,5.292mM KCl,1mmMgCl2,2mM CaCl 2,10mM HEPES,1mM甘氨酸,30mM葡萄糖,0.5mM丙酮酸钠,0.1%酚红色;渗透压325mosm / L)。

患有毒素活动试验
通过一些修饰进行硫氧菊酯“降低胰岛素降低测定”。简而言之,在最小培养基TMO中生长细胞24小时,然后通过在150μL裂解缓冲液/ 35mm培养皿上刮下冰(20mM HEPES pH 7.9,100mM KCl,300mM NaCl,10mM EDTA,0.1%TritonX-100,1:100蛋白酶抑制剂鸡尾酒III-CALBIOCHEM在预热的TMO培养基中洗涤两次后。将细胞裂解物收集在微量离心管中,通过在4℃下以10000rpm离心3分钟丢弃的细胞碎片。将含有30μg蛋白质的合适体积的裂解物在裂解缓冲液中稀释至终体体积为34μL。[我们测试了一系列蛋白质浓度,以选择落入反应的线性范围内的蛋白质浓度,从已显示在该测定的线性范围内的蛋白质开始以前。替代地或另外地,可以包括使用纯化的硫化辛的标准曲线以确认测定的线性范围。]1μlDTT活化缓冲液(50mM Hepes pH 7.6,1mM EDTA,1mg / ml BSA,2mM DTT)加入所有管。混合后,将管在37℃下在水中孵育15分钟,以减少内源性硫氧嗪。然后将20μl反应混合物(200μL1MHEPESPH7.6,40μL0.2MEDTA,40μLNADPH 40mg / ml和500μL胰岛素10mg / ml)加入每个管中,以及0.5单位的TRX还原酶或 H2o对于阴性对照,将样品在37℃温育20分钟。通过加入250μl止动缓冲液(6M胍HCl,1mM DTNB(Sigma)在0.2M Tris-HCl pH 8.0中)停止反应,将200μl样品转移到96孔板中,并测量吸光度405 nm在BMG L德赢vwin官网客服abtech酶读卡器中。


测定原则

(1)TRX-S2+ DTT.→trx-(sh)2+ DTT.
(2)TRX-(SH)2+胰岛素-S2→trx-s2+胰岛素 - (SH)2TrxR
(3)TRX-S2+ NADPH + H +→TRX-(SH)2+ nadp.+
(4)胰岛素 - (SH)2+ dntb→insulin-s2+ 2 tnb(亮黄的)

样品中的内源性硫氧嘧啶(Trx)首先通过二硫噻钛糖醇(DTT,用于氧化形式的氧化氧和氧化镁)减少;(反应1)。在添加NADPH,胰岛素和硫辛辛还原酶(TRXR)后,TRX减少了胰岛素二硫化物(反应2)。在TRXR的存在下并且以NADPH为代价,可以减少TRX并将其带回系统(反应3)。当反应停止时,将巯基团衍生至TNB(反应4),其给出强烈的黄色。


免疫细胞化学和细胞计数
将细胞培养物用3%多聚甲醛和4%蔗糖固定在室温(室温)中20分钟,然后在补充0.5%NP-40的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中渗透5分钟。将细胞在4℃的PBS中孵育过夜,用胶质纤维酸蛋白(GFAP)(1/2000; sigma)和神经元核(Neun; 1/15; Chemicon),以染色胶质细胞(星形细胞)和神经元, 分别。NUUN染色完成,用生物素化抗小鼠(1/200)孵育1小时;(杰克逊免疫研究)抗体,然后用Cy3偶联的链霉抗生物素蛋白(1/500)孵育1小时。


GFAP染色与Alexa 488偶联抗兔(1/500)抗体(杰克逊免疫研究)在室温下孵育1小时。在用含DAPI的溶液(Vectashield; Vector Laboratories)安装后,观察细胞,使用由LAS软件驱动的Leica倒的离荧光显微镜的10x或20x目的进行图像。计算细胞(盲)以使用imagej软件建立每种培养类型(DAPI染色)的细胞总数和Neun阳性和GFAP阳性细胞的百分比。

成绩与讨论

我们在纯粹的胶质细胞培养物中并行地进行了肝素活性测定和混合神经元 - 胶质培养物(其后称为“皮质”),其在营养不良剥夺24小时。在BMG Labtech微板中测量吸光度,对每个样品进行没德赢vwin官网客服有硫化素还原酶酶的对照反应,并从含有TRXR的样品的值中减去该值。

同时,我们使用免疫染色以确定每种类型培养物中存在的细胞数量。


从肝癌活性测定法与来自平行菜肴的细胞计数相结合,使用该公式计算混合皮质培养中神经元在混合皮质培养中的硫氧嘧啶活性,相对于胶质细胞的活性,使用该公式计算:“(胶质细胞/皮质)的数量。盘子)*神经胶质活性+(神经元细胞/皮质次数)*神经元活动=(与胶质培养的皮质中的TRX活性的折叠增加)*(胶质细胞/胶质盘的数量)*胶质活动“。因此,神经元的硫氧嘧啶活性高于胶质细胞的3.8±0.86倍(图1)。由于混合皮质培养物中的胶质细胞代表4-9%的细胞总数,因此胶质细胞代表的硫氧嘧啶活性仅为该培养物中总甲卓素活性的1-2.5%。

结论

在我们的系统中,1-2.5%的初级皮质培养物中的嗜毒毒素活性可归因于胶质细胞,即使胶质细胞占总细胞数的4-9%。因此,神经元对混合大鼠皮质培养物中的绝大多数嗜毒素活性负责。可以在BMG Labtech微孔板读卡器上轻松进行硫醚活性测定。德赢vwin官网客服

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