竞争性珠基荧光法定量抗体浓度

介绍

细胞系发育的目的是产生具有稳健的细胞系，显示出优化的生长并产生高滴度，例如单克隆抗体。为此，将成千上万的细胞克隆作为单细胞接种，并且在384孔微孔板的孔中生长。传统上，这种克隆文库的高表现细胞必须使用Western印迹或ELISA等方法来识别。两种方法都非常耗时，需要大量的材料以及放电时间。

为了克服这些缺点，公司Paia Biotech创造了一种基于珠的测定，允许以高通量形式分泌细胞系分泌蛋白的量化。该技术具有特殊的384孔板（PAIA板），在黑色井底上具有金字塔形透明突起，这允许分离珠子和检测溶液中的流荧光。在Clariostar中成功测量了三种不同的单克隆抗体^®来自BMG Labtech的微孔板读卡器。德赢vwin官网客服

测定原理

该试验利用链霉亲和素包被的捕获珠，其中一定数量的生物素化蛋白a结合。荧光标记物，一种fitc标记的人类抗体，与分析物竞争结合蛋白a(图1)。

分析工作流程如图2所示。当加入缓冲液和分析物(2A)时，捕获珠已经存在于井中。通过轨道微孔板振荡45分钟来捕获分析物(B)。在15分钟的分离时间内，与分析物或荧光标记物结合的珠子将沉淀下来(C)。最后从底部测量微孔板。只有孔中间的突出部分是透明的，以便荧光信号读出(D)。孔中分析物越多，fitc标记的抗体被替换越多，从而产生高荧光信号。

材料与方法

• 来自PAIA生物技术公司的竞争性人IgG Fc试剂盒，包括PAIA 384孔微孔板
• 轨道平板振动筛(例如Q. Instruments公司的BioShake XP)
• 单克隆抗体香橼蛋白，Rituximab和Panitumumab购自常见的商业来源
• CLARIOstar^®microplate reader来自BMG 德赢vwin官网客服LABTECH

标准曲线的制备
向每个孔中加入54μL含PPAIA混合物和FITC标记的抗体，其中已经预先分配了蛋白质偶联的捕获珠粒。使用电子多通道移液管加入6μL不同浓度的标准。作为标准的标准，使用了三种不同的单克隆抗体：香橼（注册商品名Erbitux^®），Rituximab（Mabthera注册商品名称^®)和Panitumumab(注册商品名Vectibix)^®）。

震动和沉降
在加入PAIA混合和标准后，应采用以下摇动和沉降计划：

• 用振动筛1800转45分钟
• 在轨道振动器上以1000 rpm 5分钟
• 无搅拌10分钟

CLARIOstar仪表设置

检测模式：	荧光
方法:	下阅读
光学设置:	单色仪预设荧光素/FITC
不。闪光:	40
专注并获得:	需要调整

结果与讨论

进行了光谱扫描，以确定典型的FITC设置是否适合于检测(图3)。

扫描显示，FITC的标准单色仪设置可以用于PAIA分析(预设荧光素/FITC)。4个重复，每个标准浓度的平均CV为3%。

测量完实验板后，数据可以很容易地用火星数据分析软件进行处理。应采用4或5个参数的拟合(图4)。