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竞争性珠基荧光法定量抗体浓度

Christine Wosnitza (1) Sebastian Giehring (1) Franka Maurer (2) (1) PAIA Biotech GmbH (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 12/2015
  • 2-10之间的样本容量低µl
  • 384孔微孔板的检测时间为60分钟

表的内容

介绍

细胞系发育的目的是产生具有稳健的细胞系,显示出优化的生长并产生高滴度,例如单克隆抗体。为此,将成千上万的细胞克隆作为单细胞接种,并且在384孔微孔板的孔中生长。传统上,这种克隆文库的高表现细胞必须使用Western印迹或ELISA等方法来识别。两种方法都非常耗时,需要大量的材料以及放电时间。


为了克服这些缺点,公司Paia Biotech创造了一种基于珠的测定,允许以高通量形式分泌细胞系分泌蛋白的量化。该技术具有特殊的384孔板(PAIA板),在黑色井底上具有金字塔形透明突起,这允许分离珠子和检测溶液中的流荧光。在Clariostar中成功测量了三种不同的单克隆抗体®来自BMG Labtech的微孔板读卡器。德赢vwin官网客服


测定原理

该试验利用链霉亲和素包被的捕获珠,其中一定数量的生物素化蛋白a结合。荧光标记物,一种fitc标记的人类抗体,与分析物竞争结合蛋白a(图1)。

分析工作流程如图2所示。当加入缓冲液和分析物(2A)时,捕获珠已经存在于井中。通过轨道微孔板振荡45分钟来捕获分析物(B)。在15分钟的分离时间内,与分析物或荧光标记物结合的珠子将沉淀下来(C)。最后从底部测量微孔板。只有孔中间的突出部分是透明的,以便荧光信号读出(D)。孔中分析物越多,fitc标记的抗体被替换越多,从而产生高荧光信号。

材料与方法

  • 来自PAIA生物技术公司的竞争性人IgG Fc试剂盒,包括PAIA 384孔微孔板
  • 轨道平板振动筛(例如Q. Instruments公司的BioShake XP)
  • 单克隆抗体香橼蛋白,Rituximab和Panitumumab购自常见的商业来源
  • CLARIOstar®microplate reader来自BMG 德赢vwin官网客服LABTECH

标准曲线的制备
向每个孔中加入54μL含PPAIA混合物和FITC标记的抗体,其中已经预先分配了蛋白质偶联的捕获珠粒。使用电子多通道移液管加入6μL不同浓度的标准。作为标准的标准,使用了三种不同的单克隆抗体:香橼(注册商品名Erbitux®),Rituximab(Mabthera注册商品名称®)和Panitumumab(注册商品名Vectibix)®)。


震动和沉降
在加入PAIA混合和标准后,应采用以下摇动和沉降计划:

  • 用振动筛1800转45分钟
  • 在轨道振动器上以1000 rpm 5分钟
  • 无搅拌10分钟

CLARIOstar仪表设置

检测模式: 荧光
方法: 下阅读
光学设置: 单色仪预设荧光素/FITC
不。闪光: 40
专注并获得: 需要调整

结果与讨论

进行了光谱扫描,以确定典型的FITC设置是否适合于检测(图3)。

扫描显示,FITC的标准单色仪设置可以用于PAIA分析(预设荧光素/FITC)。4个重复,每个标准浓度的平均CV为3%。


测量完实验板后,数据可以很容易地用火星数据分析软件进行处理。应采用4或5个参数的拟合(图4)。

西妥昔单抗和利妥昔单抗均为IgG1型,显示出一致的5参数拟合曲线,表明与蛋白a的亲和力相似。帕尼单抗是一种IgG2抗体,因此表现出不同的行为,从不同的曲线进展可以看出。因此,该实验覆盖了不同浓度范围的IgG1和IgG2。IgG1的定量范围为10-200,IgG2的定量范围为5-2000µg/mL。

在CLARIOstar上可以使用LVF monochromatorTM或FITC滤波器来测定PAIA的含量。表1显示了R2和使用任一配置获得的LoD值。


表1:R2以及单色仪和滤光片测量灵敏度的比较。

西妥昔单抗 利妥昔单抗 Pantumumab
R25-parameter适合
LVF单色仪 0.9962 0.9960 0.9997
过滤器 0.9973 0.9964 0.9994
敏感性µg / ml *
LoD单色仪 10.2 13.9 6.2
LoD过滤器 11.5 13.5 5.2

*使用以下公式计算LOD:LOD = 3 o0+ y0,其中y0为平均空白信号(物质浓度几乎为0),o0为平均空白信号的标准偏差。

结论

用BMG LABTECH公司的CLARIOstar微孔板读卡器进行荧光底读,成功地测定了IgG PAIA的含量。德赢vwin官网客服PAIA板的特殊结构与BMG LABTECH所有能够进行荧光强度测量的仪器兼容。德赢vwin官网客服竞争检测格式不限于单克隆抗体检测,但可以扩展到各种蛋白质和抗体片段。

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