CRISPR / CAS9基因组编辑细胞表达纳米级供体，可以监测蛋白质互动和贩运

介绍

G蛋白偶联受体(GPCRs)是一种跨膜蛋白，将细胞外刺激传递到细胞内。通过刺激分子(如神经递质、激素或趋化因子)的激活，启动信号级联，导致细胞反应。例如，趋化因子CXCL12激活受体CXCR4，导致G蛋白激活和β-抑制素的招募²。随后，将受体内化以循环到血浆膜或溶酶体分解。

GPCR是需要受体 - 蛋白质相互作用和交通研究的重要药物靶标，以揭示它们的功能。生物发光谐振能量转移（BRET）是一种多功能工具，用于研究这种相互作用和交通率。然而，它受标记的相互作用伙伴的异位表达有限。CRISPR / CAS9基因组编辑通过使荧光素酶标记的蛋白质的内源性表达克服了限制。

测定原则

BRET使用荧光素酶，在存在底物中产生蓝光。如果合适的FL uorophore非常接近并且适当的取向，则发出较少的光并且转移谐振能量。因此，可以通过将Fl uorophore发射与荧光素酶信号相关来监测FL毒细胞和荧光素酶标记的蛋白质的相互作用。

CRISPR / CAS9基因组编辑方法在精确的靶位部位发生DSDNA。在供体DNA模板的存在下，同源导向的修复导致供体序列的插入。

CRISPR / CAS9使得将纳米琥珀酶（NLUC）的DNA与HEK293FT细胞CXCR4的内源基因组轨迹插入。得到的CXCR4 / Nluc融合蛋白充当布雷特供体，克服了对外源供体表达的需求。

材料与方法

• 白色96孔板（Greiner）
• Clariostar.^®和卢米斯塔^®（德赢vwin官网客服BMG Labtech）
• CXCL12 (pre - protech)， AMD3100 (Sigma-Aldrich)，异丙肾上腺素(Sigma-Aldrich)
• 富嗪（Promega）

实验程序
详细描述请参见White等人(2017)。简单地说，CRISPR/Cas9基因编辑的表达CXCR4/Nluc的HEK293FT细胞，使用Fugene基因转染带有受体荧光团的编码蛋白的cDNA^®6（Promega）。将转染细胞与荧光素酶底物孵育后48小时富硫嗪，并在ClarioStar或Lumistar Omega上分析了滤液的光排放。

设置通过实验稳定
发光，顶视镜，板模式
测量间隔时间1 s
在37℃下孵育
视镜设置（过滤器或单色器和[收益]）
图。1	图2	图3.
Clariostar. 过滤器 nluc 450-60（3400） 金星570-100（2800）	Clariostar. 单色仪 Nluc 450 - 60 (3600) 金星550 - 60 (3600) HaloTag 660 - 100 (3200)	灯光癖 过滤器 nluc 475-30（3200） 金星535-30（3600）
周期数/循环时间
40/33秒	30/49 s	60/31 s

成绩与讨论

通过将其与外源表达β-inscrectin-2 / Venus组合（图1A）来研究表达CXCR4 / Nluc表达CXCR4 / Nluc的基因组细胞对受体相互作用报告的适用性。在用其配体CXCL12激活CXCR4时，募集β-arceStin2，如BRET比率的增加所报道的（图1B，紫色）。CXCR4拮抗剂AMD3100抑制CXCL12诱导的β-ancirctin2的募集，如CXCR4 / Nluc和β-ArcketIn2 / Venus之间的能量转移的降低所见（图1B，橙色）。

内源性表达CXCR4 / Nluc的基因组编辑细胞进一步用于研究受体的内化和TRAF FICKing。为此，通过融合到Halotag的K-Ras片段和作为质子膜和早期内胚胎标记物的RAB4-VENUS融合蛋白，细胞瞬时共转染。（图2A）。随着金星和卤橡胶的信号可以使用ClarioStar的单色仪分离，在一个实验中确定各种蛋白质的布雷特比。加入激动剂后，CXCR4从K-RAS标记物的布雷特比的降低分离出报告的血浆膜（图2B，橙色）。同时，观察到BRET比率的增加和受体和RAB4的接近度（图2B，紫色）。数据表明受体从质膜从血浆膜捕获到早期内体。