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CRISPR / CAS9基因组编辑细胞表达纳米级供体,可以监测蛋白质互动和贩运

卡尔·怀特(1,2)伊桑·西(1,2) (1)分子内分泌和药理学,哈里珀金斯医学研究所,澳大利亚(2)医学研究中心,西澳大利亚大学,澳大利亚(3)Dimerix Limited,Nedlands,澳大利亚 01/2018
  • CRISPR / CAS9基因组编辑使得内源性表达和调节BRET供体标记的蛋白质
  • 两种蛋白质融合到不同的受体fl uorophores监测受体交通
  • Clariostar.®使用滤波器或LVF Monochromator™在纳米级测量中表现出高灵敏度

介绍

G蛋白偶联受体(GPCRs)是一种跨膜蛋白,将细胞外刺激传递到细胞内。通过刺激分子(如神经递质、激素或趋化因子)的激活,启动信号级联,导致细胞反应。例如,趋化因子CXCL12激活受体CXCR4,导致G蛋白激活和β-抑制素的招募2。随后,将受体内化以循环到血浆膜或溶酶体分解。


GPCR是需要受体 - 蛋白质相互作用和交通研究的重要药物靶标,以揭示它们的功能。生物发光谐振能量转移(BRET)是一种多功能工具,用于研究这种相互作用和交通率。然而,它受标记的相互作用伙伴的异位表达有限。CRISPR / CAS9基因组编辑通过使荧光素酶标记的蛋白质的内源性表达克服了限制。

测定原则

BRET使用荧光素酶,在存在底物中产生蓝光。如果合适的FL uorophore非常接近并且适当的取向,则发出较少的光并且转移谐振能量。因此,可以通过将Fl uorophore发射与荧光素酶信号相关来监测FL毒细胞和荧光素酶标记的蛋白质的相互作用。


CRISPR / CAS9基因组编辑方法在精确的靶位部位发生DSDNA。在供体DNA模板的存在下,同源导向的修复导致供体序列的插入。


CRISPR / CAS9使得将纳米琥珀酶(NLUC)的DNA与HEK293FT细胞CXCR4的内源基因组轨迹插入。得到的CXCR4 / Nluc融合蛋白充当布雷特供体,克服了对外源供体表达的需求。


材料与方法

  • 白色96孔板(Greiner)
  • Clariostar.®和卢米斯塔®(德赢vwin官网客服BMG Labtech)
  • CXCL12 (pre - protech), AMD3100 (Sigma-Aldrich),异丙肾上腺素(Sigma-Aldrich)
  • 富嗪(Promega)

实验程序
详细描述请参见White等人(2017)。简单地说,CRISPR/Cas9基因编辑的表达CXCR4/Nluc的HEK293FT细胞,使用Fugene基因转染带有受体荧光团的编码蛋白的cDNA®6(Promega)。将转染细胞与荧光素酶底物孵育后48小时富硫嗪,并在ClarioStar或Lumistar Omega上分析了滤液的光排放。

设置通过实验稳定
发光,顶视镜,板模式
测量间隔时间1 s
在37℃下孵育
视镜设置(过滤器或单色器和[收益])
图。1 图2 图3.
Clariostar.
过滤器
nluc 450-60(3400)
金星570-100(2800)
Clariostar.
单色仪
Nluc 450 - 60 (3600)
金星550 - 60 (3600)
HaloTag 660 - 100 (3200)
灯光癖
过滤器
nluc 475-30(3200)
金星535-30(3600)
周期数/循环时间
40/33秒 30/49 s 60/31 s

成绩与讨论

通过将其与外源表达β-inscrectin-2 / Venus组合(图1A)来研究表达CXCR4 / Nluc表达CXCR4 / Nluc的基因组细胞对受体相互作用报告的适用性。在用其配体CXCL12激活CXCR4时,募集β-arceStin2,如BRET比率的增加所报道的(图1B,紫色)。CXCR4拮抗剂AMD3100抑制CXCL12诱导的β-ancirctin2的募集,如CXCR4 / Nluc和β-ArcketIn2 / Venus之间的能量转移的降低所见(图1B,橙色)。

内源性表达CXCR4 / Nluc的基因组编辑细胞进一步用于研究受体的内化和TRAF FICKing。为此,通过融合到Halotag的K-Ras片段和作为质子膜和早期内胚胎标记物的RAB4-VENUS融合蛋白,细胞瞬时共转染。(图2A)。随着金星和卤橡胶的信号可以使用ClarioStar的单色仪分离,在一个实验中确定各种蛋白质的布雷特比。加入激动剂后,CXCR4从K-RAS标记物的布雷特比的降低分离出报告的血浆膜(图2B,橙色)。同时,观察到BRET比率的增加和受体和RAB4的接近度(图2B,紫色)。数据表明受体从质膜从血浆膜捕获到早期内体。

GPCR异构体研究技术(GPCR- hit, Dimerix)报道了通过招募一个特异性的相互作用蛋白到异构体复合物来形成GPCR异构体。表达CXCR4/Nluc的细胞瞬时转染β2-肾上腺素受体和相互作用蛋白β-arrestin2/Venus的cDNA。与使用β2-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素治疗一样,使用CXCL12治疗细胞可以使β-arrestin2/Venus被招募到基因组编辑的CXCR4/Nluc中,表明β2-肾上腺素受体与CXCR4/Nluc非常接近。同时使用这两种激动剂会导致大于加性BRET信号,再次提示异质体的形成。


结论

新型CRISPR / CAS9技术成功地将Nluc BRET供体融合到内源性表达的CXCR4。由所得蛋白质 - 荧光素酶融合产生的发光是对受体 - 蛋白质相互作用以及TRAF凝固的影响。多重内化测定取决于克拉克罗斯塔的单色仪呈现选择性检测的两个受体FLUOROCHORE。


参考资料

1.白色cw等。(2017)SCI REP。7:3187。DOI:10.1038 / s41598-017-03486-2

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