用于检测GPCR的配体偏压的双通道动力学测定

演讲者:Anne Marie Quinn(CEO,蒙大拿分子),Kevin Harlen(主要调查员,蒙大拿分子),Carl Peters(高级应用科学家,BMG Labtech Inc.)德赢vwin官网客服

GPCR是最大的药物目标之一。它们的活性由G蛋白和β-inscrectins介导,其激活不同的信号通路网络。激活GPCRS的药物稳定不同构象状态的受体,以产生不同程度的不同程度的偏向G-蛋白或β-射肌信号通路。取决于受体和细胞类型,通过选择性地接合一些信号,偏置药物可以产生治疗性或不利影响,同时最小化由同一受体介导的其他信号。尽管配体偏倚对治疗药物发育的潜在影响,但传统的细胞基测定很适合检测偏差。目前的方法涉及比较ARRESTIN募集,GPCR第二信使和ERK磷酸化的一系列不同测定,每种使用不同的测定条件,模态和仪表,并在不同的细胞群中测量。


一种新的方法允许使用相同的细胞群,相同的测定模态和条件以及相同的检测仪器测量朝向G蛋白或β-ARRESTIN的激动剂偏差。荧光生物传感器测量GPCR第二信使(例如钙离子 - CA.2 +如肌醇三磷酸- IP3、二酰基甘油- DAG或环磷酸腺苷- cAMP),可与光谱分辨荧光生物传感器联合检测β-抑制素。可逆的生物传感器可以在单个微孔板中平行测量,并报告特定通路被激活的程度。BacMam传递系统确保传感器在每个所需的细胞类型,最好是与疾病相关的细胞类型中表达。BacMam转导方法适用于永生化细胞系,以及原代细胞或诱导多能干细胞(iPSCs)及其衍生的细胞,如心肌细胞或神经元。


生物传感器的表达大约需要24小时从转导。在记录两种传感器的基线荧光强度后,细胞使用板载注射器对感兴趣的化合物进行挑战。动态记录了传感器对第二信使增加或β-抑制素增加反应的荧光变化。动力学读数和高时间分辨率是高度相关的:一些响应对GPCR刺激是快速的(Ca2 +)和一些持续时间长(β-抑制素)。一个动力学读取使同时测量两个反应可能和快速读取确保记录反应的时间点。


朝向G蛋白或β-inscriptin途径的偏见可能在荧光反应对不同激动剂的最小变化中变得显而易见。因此,所获取的数据需要显示出优异的稳定性和高信噪比。随着Clariostar结合所有要求(速度,精度,灵敏度,车载试剂喷射器),它采用了建立拮抗剂偏置测定。


然后根据首先计算β-抑制素激活率和g蛋白激活率的算法对获得的数据进行分析。随后,比较两种比率,以产生偏差比率,报告对化合物的β-抑制素的偏差。


在本教程中,蒙大拿分子介绍了一种利用BMG的双通道荧光检测能力的新方法www.v66088.com 介绍一种有效实用的同时测量抑制素和g蛋白第二信使信号动力学响应的方法。我们将讨论使用激动剂对血管紧张素和血管加压素受体的分析结果,以说明在单一实验中,已知存在抑制素偏误的激动剂与不偏误或部分偏误的激动剂的区别的精确性。

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