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使用CLARIOstar和LVF单色仪检测硬化蛋白- lrp5 /6相互作用

Carl Peters(1)Courtney Noah(2) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech(2)恩佐生命科学 07/2014
  • 恩佐的领先光线®Sclerostin-LRP筛选系统是识别WNT-Pathway调制器的新型工具
  • 的CLARIOstar®可以使用LVF单色器检测该测定TM值
  • 优良的Z '值表明该方法具有较强的检测能力和较高的检测灵敏度

介绍

骨重塑是骨不断去除和更换的过程。破坏该过程可导致骨质疏松症,其特征在于骨密度低的骨密度或骨增稠特征的菌丝睾病。骨重塑涉及在骨,成骨细胞(骨吸收)和破骨细胞(骨沉积)中发现的两种细胞类型的作用。这两种细胞类型的作用由称为骨细胞的第三种骨细胞协调。Sclerostin现在已被确定为由骨细胞表达的分子,其能够调节Wnt信号传导途径,这是在调节骨形成的调节中重要的。


WNT通过与成骨细胞的LRP 5/6 - Frizzled受体结合来施加对骨形成的影响。这导致细胞内β-连环蛋白的稳定性和促进骨形成的转录调节。通过结合LRP 5/6受体硬化剂拮抗Wnt信号传导并抑制骨形成。因此,阻断菌蛋白酶LRP 5/6相互作用的治疗可以用作骨质疏松症的治疗方法。在本申请中,我们表明BMG LabTech的Clariostar酶标器可用于筛选硬化素-LRP5 / 6结合抑制剂。德赢vwin官网客服


测定原则

领先的光明TM值硬化蛋白- lrp相互作用筛选系统使用LRP5工程,使其与碱性磷酸酶(AP)酶相连。硬化蛋白被涂在96孔板上,结合的LRP5- ap通过洗涤步骤后剩余的活性进行检测(图1)。通过这种方式,各种不同的化合物可以被筛选,以了解它们破坏硬化蛋白/LRP5相互作用的能力。由于这是一种生化试验,不需要细胞系或报告基因的稳定或短暂转染。


材料与方法

  • CLARIOstar microplate读卡器来自BMG实验室德赢vwin官网客服
  • 领先的光明TM值Sclerostin-LRP互动筛选系统套件(ENZ-61003)来自Enzo®生命科学
  • 白色96孔微孔板,肋骨

根据产品手册中描述的程序制备了Sclerostin-LRP筛选试剂盒中提供的试剂和微孔板。该试剂盒含有阳性对照(LRP5-AP融合蛋白),阴性对照(仅适用于AP浓缩物)和抑制控制(酸绿25)。所有板摇动步骤都采用ClarioStar轨道摇动功能。在找到测定的测定后,加入碱性磷酸酶底物。


在孵育25分钟后,用克拉罗星测量化学发光信号。


要确定适当的单色仪设置,请使用以下仪器设置执行发射扫描:

测量方法: 发光
阅读模式: 光谱扫描
发射波长: 500 - 600 nm
发射带宽: 20海里
获得: 3600.
焦点: 11.0.

然后,通过以下调整,在克拉罗星上读取印版。

测量方法: 发光
阅读模式: 终点
测量间隔时间: 1秒
发射波长: 550.0纳米
发射带宽: various
获得: 3600.
焦点: 11.0.

成绩与讨论

使用CLARIOstar光谱扫描特性,您可以获得分辨率为1纳米的发光团的图像(图2)。

基于该实验中的广泛发射光谱,我们认为捕获从500nm至600nm的整个发射光谱将提供最佳结果。Clariostar中的LVF单色器使得可以检测到100nm的带宽。使用550-100的单色器设置,我们能够从整个光谱范围收集光。获得评估酸绿色25抑制容量对康司蛋白和LRP5之间的相互作用进行评估的优异结果(图3)。

表1提供了各种单色仪设置的比较,以评估降低带宽对测定性能参数的影响。

带宽(550-) 100海里 90海里 80海里
Avg。PC * 2,216,000 2,022,000 2,004,000
测定窗口 275. 254. 248.
Z' 0.972 0.968 0.968

Avg. PC* =阳性对照平均发光值


因为我们希望减少带宽导致RLU的减少,其与测定窗口的轻微降低相关。测定窗是阳性对照和阴性对照的比率。然而,对Z'的影响可忽略不计。


结论

CLARIOstar LVF单色仪对Enzo的领先光表现出强大的发光探测灵敏度®Sclerostin-LRP相互作用筛选系统。该测定系统和仪器证明是评估巩膜素-LRP相互作用的调节剂的优秀平台。

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