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人力蛋白质聚集的检测

Delphine Jaga(1)法兰卡·莫尔(2) (1)CISBIO(2)BMG德赢vwin官网客服 LABTECH 09/2015
  • 脑组织中TAU骨料的检测和定量
  • Tau聚集和解离的动力学
  • 小样本大小<10μl

介绍

Tau蛋白稳定大脑中的微管结构。这些结构正在支持神经元之间的营养传输。德赢Vwin安全吗Tau蛋白质异常导致结构和运输崩溃 - 将开发斑块。这是在经过神经变性的患者中发生,例如,在阿尔茨海默里。因此,患者Tau蛋白的水平可以是神经变性疾病状态的指标。为此,CISBIO开发了一种可以应用于细胞培养物,脑组织提取物和重组蛋白的TAU聚合试剂盒。


测定原则

利用夹层免疫测定测量Tau骨料,施加抗Tau单克隆抗体,其用铽碱基或D2标记,确保测定质量再现性和信号质量。生成的特定HTRF信号与TAU聚集体的量成比例(图1)。

当铽密码和D2紧邻时,HTRF供体与激光器或闪光灯的激励将导致HTRF受体的能量转移(FRET)。结果是665nm处的特定FRET信号。在620nm的波长下,测量供体排放。


图2显示了执行TAU聚合测定方案的步骤。

材料与方法

  • 来自Cisbio的Tau聚集测定试剂盒(#6ftaupeg)包括白色384井低体积微孔板
  • Pherastar.®FS.来自BMG Labtech的微孔板读卡器德赢vwin官网客服

需要仅10μl样品,并给出384孔板的孔。接下来加入5μL抗Tau-D2抗体和5μL抗Tau-TB抗体。在室温下孵育2小时后,HTRF信号在Pherastar中测量FS.微孔板读者。


仪器设置

检测方法: 时间分辨荧光,终点
视镜: 顶级光学
光学模块: HTRF 337 665 620
集成开始: 60μs.
集成时间: 400μs.
激励来源: 激光或闪光灯
同时双重发射: 是的


MARS数据分析软件的两个发射信号的结果将自动转换为HTRF比率或Deltaf%值。


成绩与讨论

测定特异性和线性
图3显示测定可以清楚地区分含有化学聚集的样品与非聚集的TAU相比。

虽然非聚集的TAU没有显示出显着增加,但聚集的TAU样品的HTRF值随浓度而增加。对TAU聚合有一种线性关系。

TAU聚集的动力学
化学聚集用于接受重组全长人TAU蛋白的聚集体。为了评估动力学参数,并联制备5个样品,并在不同时间点(1至24小时)停止反应(图4)。

该测定系统也可以应用于在复合添加后监测解离的动力学。


转基因小鼠脑提取物的TAU聚集在转基因小鼠的脑提取物样品中测定TAU聚集(TAU / PSEN2 / APP)。从这些小鼠中,已知它们随时间发育神经变性病理学(图5)。

该图表明,不仅可以用测定(红色棒)检测到后期的TAU聚集体。该测定法足够足以区分Tau纤维化的早期阶段(黄色和蓝色棒)。

结论

TAU聚合在Pherastar上成功衡量FS.微孔板读者。当样品体积非常小(<10μl)时,测定适用于检测早期原纤化。使用HTRF技术提供了几次测量样品的可能性,而不会漂白的效果。HTRF化学品的这种特性允许动力测量实时监测Tau聚集。

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