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使用BMG LABTECH酶标仪检测parp诱导的adp -核糖基化德赢vwin官网客服

A Thorsell A Pinto T Ekblad H SchŸler 斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院 10/2014
  • 使用化学发光测定测定的PARP酶活性
  • 在较宽的酶浓度范围内,发光读数是可重复的和线性的
  • 动力学参数K和集成电路50.计算酶抑制剂的值

介绍

PARP (Poly(adp -核糖)聚合酶)家族酶参与转录调控、DNA修复和染色质重塑。这些酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为底物生成聚adp -核糖。由于与疾病的各种联系,PARP酶是药物开发的目标。


在本应用笔记中,我们描述了在CLARIOstar多模酶标仪上使用化学发光法测定PARP活性。该试验允许PARP酶的动力学分析和抑制剂效能的评估。


测定原则

跟踪PARP活动在体外通过检测生物素化的ADP-核糖作为酶靶蛋白质调节或自动调制剂的结合。反应原理如图1所示。1。

将六三氨酸标记的PARP酶或蛋白质基质固定在Ni上2+- 散发微孔板。通过添加生物素化的NAD开始反应+。PARP酶使用NAD+合成生物锡基化聚(ADP-核糖)。将该聚合物添加到PARP酶本身中或转移到微孔板上的蛋白质基质(组蛋白)。加入洗涤步骤中,加入链霉抗生物素蛋白 - 缀合的辣根过氧化物酶并将其与生物素化的聚(ADP-核糖)结合。在向辣根过氧化物酶加入底物后,释放化学发光并且可以测量。


材料与方法

  • Ni-NTA涂层,不透明,白色96孔微孔板(5件)
  • 链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶(Jackson免疫研究)
  • 生物素化的河畔+(Trevigen)
  • Supersignal West Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scienti Fi C)
  • 来自BMG Labtech的微孔板读卡器德赢vwin官网客服

所有标准化学品和一次性用品都是通过正常的分销渠道获得的。


酶促反应
将六组氨酸标记的PARP酶或蛋白质底物固定在镍上2+- 平等板。通过添加NAD开始ADP-核糖基化反应+(2%生物素化)在20°C。加入7 M盐酸胍停止反应。用反应缓冲液冲洗板孔,用含0.02% Tween-20 (TBST)和1% (w/v) BSA的tris缓冲盐水孵育30分钟,用TBST冲洗。与链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶(0.5 μg/ml)孵育后,再进行洗涤。加入SuperSignal West (50 + 50 μl,未稀释)作为过氧化物酶化学发光底物后,在CLARIOstar酶标仪上按以下仪器设置进行检测。


仪器设置
所有测量(线性范围检查,K测定和抑制剂剂量 - 反应)在端点模式下进行。

视: 使用顶级光学器件
测量间隔时间: 1.00
presetname:
排放: 全量程(无滤镜)
获得: 测量前需要调整
焦高度: 测量前需要调整

成绩与讨论

为了验证ADP-核糖基转移酶测定法测定通过稀释系列生物素-ADP-核糖基化酶获得的信号的线性范围(图2)。结果表明,信号在宽范围的ADP-核糖基浓度上是线性的。

使用初始反应速率测定PARP酶系列成员的动力学参数。独立实验表明,与共底衬底连接的生物素部分在反应动力学上没有在反应动力学上的影响(结果未显示)。

K的知识允许测定抑制剂剂量 - 响应曲线和实验参数(IC50.)。

结论

在BMG LABTECH酶标仪中进行的PARP酶adp核糖基化分析显示,在广泛的酶浓度范围内(0.015至300 nM德赢vwin官网客服)均呈信号线性。该试验允许酶的表征和计算不同的参数,这对酶抑制剂等药物的开发很重要。

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