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AlphaScreen模式下酪氨酸激酶活性的检测

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  • AlphaScreen®酪氨酸激酶检测使用激光或闪光灯配备的酶标仪
  • 高Z'值表示高稳健的测定与高质量仪器相结合
  • 灵敏度测定为每孔≤100 amol biot-LCK-P

表的内容

介绍

酪氨酸激酶是细胞过程的重要调节因素,包括细胞周期进展,代谢和细胞凋亡。已发现激酶参与如例如。癌症和心血管疾病;因此,预期调节激酶功能的分子是有希望的新药。有不同的均匀技术可用于执行激酶测定。在本申请中,我们将描述使用alphascreen的酪氨酸激酶测定的性能®(放大发光邻近均匀测定)方法。


测定原理

alphascreen®实验使用单态氧从供体到受体珠的扩散。供体微珠在680 nm激光激发下,以每秒60000个分子的速度将周围的氧转化为单态氧。单态氧分子的寿命很短(在水溶液中为4µs),扩散不超过200nm。当生物分子相互作用使供体和受体珠接近时,单态氧到达受体珠后,一连串的化学反应被触发,在520 - 620 nm范围内产生放大的发光信号。alphascreen®p - tyr100检测方法(图1)基于夹层检测原理。

在酪氨酸激酶磷酸化之后,将生物素化的多肽底物夹在链霉抗生物素蛋白(SA)涂覆的供体珠和抗磷酸酪氨酸抗体缀合的受体珠。多肽通过酪氨酸激酶的磷酸化导致发光信号的增加。

材料与方法

  • P-Tyr-100测定套件,PerkinElmer
  • 白色384孔小卷板,格雷纳生物一号

p - tyr100(磷酸酪氨酸)检测试剂盒在AlphaScreen中进行®模式按照白色384的套件协议 - 井小体积板,具有17μL的固定体积。供体和受体珠子以20μg/ ml的浓度使用。alphascreen®组件是光敏的;因此,珠子不应暴露在强光下。珠子最好在柔和或绿色过滤光下处理。在室温下孵育一小时后读板。384孔板的仪器设置如下所示。


仪器设置

Flyostar / Polartar Omega Clariostar. PHERAstarFS.
检测模式 AlphaScreen®
方法 端点,顶级视镜
光学设置 ex-filter:前任
EM-Filter:EM
ex-filter:前任
EM-Filter:EM
AlphaScreen
光学模块
激发时间 0.3秒
集成开始 0.34秒
积分时间 0.3秒

结果与讨论

进行含有生物素化的和磷酸化的多肽(Biot-LCK-P)覆盖50nm至5μm的含有生物素化和磷酸化的多肽(Biot-LCK-P)以证明试剂盒性能(图2和图3)。

在图2和3中产生的滴定曲线非常紧密对应于在套件协议中发布的曲线。为了表明没有良好的变化没有显得良好的变化,可以使用24个重复进行测定,每个浓度和空白进行。图4显示了井测量的高一致性。

图4显示了井测量的高一致性。得到的2.2%CV(5nm Biot-LKC-P)还证明了稳定的测量。从这些测定数据中,计算了0.93的代表性Z'值和每孔的≤100AMOL生物-LCK-P的LOD(检测限)。


结论

AlphaScreen®在PHERAstar上进行酪氨酸激酶分析FS.结果是重复井的数值非常一致。Z’值为0.93,表示该方法具有良好的检测性能。Z '值在0.5到1之间表明是一个非常稳健的筛选方法,反映了仪器的高质量。


该测定在384孔格式上成功地在Flyostar Omega和Polarstar Omega进行。虽然没有可用的激光,但专用针对字母屏幕优化®提供获得敏感和一致数据的可能性。计算ω读者的Z'值计算为> 0.8,而检测限为每孔≤100AMOLBiot-LCK-P。


对于Pherastar.FS.其中,CLARIOstar和Omega系列的读卡器的检测限是相同的。这就产生了一个强有力的假设,即检测方法本身是有局限性的。

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