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HTRF胰岛素快速检测方法的建立

Z.J. Farino (1) T.J. Morgenstern (1) J. Vallaghe (2) N. Gregor (2) P. Donthamsetti (1) P.E. Harris (1) N. Pierre (2) R. Freyberg (3) F. Charrier-Savournin (2) J.A. Javitch (1) Z. Freyberg (1) (1)哥伦比亚大学(2)西斯比奥(3)Yeshiva大学 04/2016
  • 直接测量胰岛素对于进一步了解胰岛素释放是必要的
  • 均匀的HTRF胰岛素测定证明适用于HTS

概要

直接测定胰岛素是研究葡萄糖刺激胰岛素释放机制的必要手段。和西斯比奥,一个HTRF®基于基于胰岛素检测测定。该测定提供了快速且具有成本效益的结果,并证明适合HTS目的。

将细胞或上清液中的分泌胰岛素转移到新的微孔板中,加入偶联与HTRF化学的抗体。在短暂孵化时间之后,检测信号。使用HTRF测量PHERAstar®FS略微镀板读者这是为了优化HTRF检测而设计的。

该试验能检测多种类型的胰岛素。还举例说明了人类、啮齿动物、猪或牛的胰岛素。该系统进一步适合于检测调节因子对胰岛素分泌的影响。

介绍

当胰岛素分泌不被适当调节时,它会导致广泛的代谢问题,从而导致糖尿病1。因此,胰岛素的直接测量对于阐明葡萄糖刺激释放的机制以及胰岛素释放多巴胺能调节剂的作用是必不可少的2


在这里,我们展示了基于均匀时间分辨的流动荧光(HTRF)检测方法的胰岛素检测测定的发展(图1)。通过掺入Pherastar的技术辅助该HTRF测定的检测FS.,旨在优化HTRF检测。这种HTRF胰岛素测定提供了快速且具有成本效益的结果。该测定进一步能够检测来自各种物种的胰岛素。使用胰岛素分泌细胞系和组织进行性能,并且测试表明该系统适用于检测调节剂对胰岛素分泌的影响。

测定原则

这种HTRF胰岛素检测依赖于两种胰岛素结合抗体(图2)。一种抗体用隐铕供体标记,第二种抗体用近红外受体标记。当两种抗体都与胰岛素结合时,它们的距离足够近,从而发生FRET(荧光共振能量转移)。由于供体的性质,测量开始前可以设置一个时间延迟,以减少来自其他分析组件的瞬态干扰。

材料与方法

  • 96孔(半面积)或384孔,白板(GREINER)
  • 抗胰岛素:欧盟和抗胰岛素:XL665(CISBIO)
  • 啮齿动物胰岛素(ALPCO)
  • 溴杉裂甲磺酸盐(Tocris)
  • PHERAstarFS.微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服

其他化合物均从sigma公司获得。有关小鼠胰岛分离、细胞培养和胰岛素分泌修饰化合物处理组织和细胞的详细信息请参见Farino和Morgenstern等人。2


通过将抗胰岛素抗体加入1:1的比例(总抗体体积:样品体积)来进行HTRF胰岛素检测测定。在25℃温育25℃后,在pH 7缓冲液中,在Pherastar上读取板FS.


PHERAstarFS.仪器的设置

测量类型: 时间解决了荧光
测量模式: 端点
光学模块: HTRF (337/665/620)
焦点: 试运转前调整
集成开始: 40μs
积分时间: 100μs
激励源: 闪光灯
闪光/良好: One hundred.

成绩与讨论

我们检测了HTRF胰岛素检测多种胰岛素的能力(图3)。结果表明,该检测方法适用于人类细胞和各种动物模型。

在0.01 - 10 nM浓度范围内(n = 3)检测人类、啮齿动物、猪或牛的胰岛素时,没有观察到HTRF信号的显著差异。


通过Z’-因子的测定进一步评估了该方法对高通量筛选的适用性。图4显示了不同胰岛素浓度下标准品各井间的变化情况。

结果基于40个重复,表明该检测确实适合高温热休克应用(Z´= 0.85,计算2.5 ng/ml胰岛素和10 ng/ml胰岛素样品)。


为了进一步阐明该实验的潜力,我们测试了溴隐亭,一种已知的多巴胺D2/D3受体激动剂可能直接作用于胰岛的假说。如图5所示,溴隐亭可以抑制葡萄糖刺激的小鼠胰岛胰岛素分泌。

结论

HTRF胰岛素检测是一种简便快捷的同质检测方法。这里显示的结果表明了该检测方法对中/高通量的适用性。此外,它可以以非常低的成本执行($ 0.02 /样本)2


参考资料

1.Kahn SE等人(2006)肥胖与胰岛素抵抗和2型糖尿病的机制Nature 444:840-846。
2. Farino ZJ和Morgenstern TJ等。(2016)通过均匀时间分离的荧光PLO 11:E0148684的快速胰岛素测定的发展。
3.Claret EJ等人(2004)人/大鼠胰岛素的高通量HTRF检测。Cisbio国际。SBS海报。

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