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在分光星纳米上用小体积样品、微孔板和试管进行DNA测量

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  • 样品体积的LVIS板小至2μL
  • 提出了基于比色皿和基于微孔板的测量的敏感性

表的内容

介绍

吸光度测量
定义吸光度
一般来说,溶液中的大多数物质都能吸收特定波长或波长范围内的光。这意味着在发送一定数量的光(I0.)通过溶液,之后将检测到减少的光量(I)。

在溶质的吸光度和浓度之间存在直接的线性关系,直到一定的限制。这一关系显示在啤酒兰伯特或啤酒法中。

比尔定律:A = b·c·e

b = pathlength [cm]
c =溶液中吸收物质的浓度[mol/l或M]
E =特定物质常数[cm-1 m-1](消光系数)


本文介绍了用吸光度法直接测定DNA的方法。


脱氧核糖核酸
存在于所有生物体内的DNA核苷酸由一个糖主链、一个碱基(胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶)和一个磷酸基组成。富氮碱基在260nm处吸收光,该波长可用于测定DNA浓度。随着DNA研究的深入,dsDNA、ssDNA和RNA的消光系数已经广为人知。在1cm的路径长度上系数的倒数可以作为一个因素来确定核酸的浓度。


表1:核酸的消​​光系数的往复值。

核酸 1 /消光系数[mg / ml]1
双链DNA 50.
单链DNA 33.
核糖核酸 40.

1使用1厘米光通路长度,核苷酸在260 nm的消光系数是20 /厘米/ m .基于这个吸光度在260 nm 1厘米石英试管50μg / mL解决方案的双链DNA, 33μg / mL单链DNA溶液或40μg / mL单链RNA溶液都等于1 OD。


消光系数使得DNA测量能够在不准备标准曲线的情况下进行测量。


pathlength校正
与SPECTROstar®纳米可以在比色皿中测量,也可以在微孔板中测量。基于比色皿的测量表明,所有吸光度值都自动归一化为1cm的优点。这些值可以直接用于计算使用啤酒的定律(公式2)和已知的消光系数(表1)的DNA浓度。


在微孔板中,该路径长度将根据井中的液体体积以及井的高度和尺寸(即96〜384孔板)而变化。为了获得可用于啤酒定律的数据,必须将吸光度结果标准化为1cm的路径长度(等式2中的B)。可以通过许多方法实现路径长度校正:

  • 使用具有定义路径长度的酶标(例如LVIS板,Pathlength = 0.5mm)。拍摄OD测量,然后应用标准乘法值以实现1cm的路径长度。
  • 使用PathLength校正功能在标准微孔板的软件中。使用的体积和微孔板在测试协议中指定,然后将算法应用于数据。
  • 使用已知的水峰值校正来标准化数据。

使用水峰值校正的一个优点在于其他方法是,如果需要,可以为每个良好的允许将不同的体积分配到一个微孔板中的每个孔产生路径长度,更重要的是该方法还将校正样品制备期间可能发生的误差。


纯度确定
DNA样品可含有影响260nm的值的杂质。因此,建议还测量杂质最大吸光度的波长:

1.蛋白质污染(280nm)
2.被酚,硫氰酸盐污染(230 nm)
3.微粒引起的光散射(340 nm)

一种常见的纯度检查是计算260/280的比率,以寻找蛋白质污染。纯DNA的比率为1.8 - 2.0,而纯RNA的比率为~ 2.0。高质量的样品应在1.7以上。另一个常用的步骤是用260或280 nm的OD值减去340 nm的OD值来校正散射光的OD值,这大大减少了标准偏差,增加了测量的灵敏度。

材料与方法

  • UV-Cuvettes从品牌半微米半微米
  • 来自Greiner的UV星级96孔板
  • 黑色384孔叶片μclect,COC来自Greiner的UV底部
  • 光谱纳米配备兰维斯板

通过正常的分配渠道获得鲱鱼精子dsDNA和HPLC级水。


结果与讨论

使用旱地板的DNA测量
LVis板是一种特殊的微孔板,含有16个位点,适合于测量2 μL的样品。在移液到LVis板上的微滴孔后,盖子闭合,所有16个位置产生0.5 mm的路径长度。用LVis板测量的dsDNA标准曲线如图1所示。

灵敏度值(LOD)将取决于可以测量空白的可靠性。将LVIS板的DNA敏感性计算为<2μg/ mL。


用标准的微孔板进行DNA测量
在微孔板中,当使用最大可能体积产生较长的路径长度时,可获得最佳灵敏度。这通常是可以的,但如果样本有限,用户通常会使用尽可能低的容量。因此,有必要在体积和灵敏度之间找到最佳的折衷。表2为不同孔板中不同体积的检测限。表2中的数据进一步表明,在340 nm处对数据进行校正通常会获得更高的灵敏度。

表2:96孔和384孔板中的DSDNA敏感性。

板格式 基于a的μg/μl260. 基于a的μg/μl260.——一个340.
96 350μL 0.39 0.24
96 300μl. 0.22 0.20
96 200μL 0.45 0.36
96 100μl. 1.03 0.82
96 50μl. 1.3 1.3
384. 20μL 1.9 0.53
384. 5μL 2.8 2.4
384. 3μL 2.7 2.4

使用比色皿的DNA测量
如果需要确定有限数量的样品,则在实验室中测量比色皿中的DNA含量仍然是常见的。比色皿测量具有优点,即所得的吸光度值已经标准化为1cm。图。图2显示了比色皿中的DSDNA测量结果。

如图2所示,在低DNA浓度范围内,在试管中实现了高线性(R2 = 0.9999)。一个空白更正和260.——一个340.建议使用参考以获得最高灵敏度(<0.2μg/ ml)。


结论

使用Spectrastar测量DNA样品有不同的可能性纳米。如果有足够的DNA材料并且只有几个应该测量的样品,则可以进行比色皿测量。对于较高的产量,应使用酶标蛋白。如果样品体积非常有限,则建议使用LVIS板,因为它提供了很大的线性范围,因此需要高灵敏度和仅需要2μL样品。

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