- 样品体积的LVIS板小至2μL
- 提出了基于比色皿和基于微孔板的测量的敏感性
介绍
吸光度测量
定义吸光度
通常，溶液中的大多数物质能够在特殊波长或波长范围内吸收光。这意味着在发送限定量的光线之后（i0.）通过解决方案，之后将检测减少的光量（i）。
在溶质的吸光度和浓度之间存在直接的线性关系，直到一定的限制。这一关系显示在啤酒兰伯特或啤酒法中。
啤酒法：A = B·C·E.
b = pathlength [cm]
C =溶液中吸收物质的浓度[mol / l或m]
E =特定物质常数[cm-1 m-1]（消光系数）
在本技术应用中，说明使用吸光度的直接测定DNA。
脱氧核糖核酸
在所有生物体中存在，DNA核苷酸由糖骨架，碱（胸腺嘧啶，鸟嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶）和磷酸基团组成。富含氮的碱在260nm处吸收光，该波长可用于确定DNA浓度。随着DNA如此高度研究，众所周知，DSDNA，SSDNA和RNA的消光系数是众所周知的。在1cm的分辨率下的系数的往复值可以用作确定核酸浓度的因素。
表1：核酸的消光系数的往复值。
| 核酸 | 1 /消光系数[mg / ml]1 |
| 双链DNA | 50. |
| 单链DNA | 33. |
| RNA. | 40 |
1利用1cm的光程度的光程度，每个核苷酸在260nm处为每厘米的核苷酸的消光系数为每厘米20μm。根据该50μg/ ml双链DNA溶液的1-cm石英粉皿中的260nm处的吸光度，33μg/ ml的单链DNA或40μg/ ml的单链RNA溶液均等于1个OD。
消光系数使得DNA测量能够在不准备标准曲线的情况下进行测量。
pathlength校正
与Spectrastar.®纳米可以在比色皿中测量，也可以在微孔板中测量。基于比色皿的测量表明，所有吸光度值都自动归一化为1cm的优点。这些值可以直接用于计算使用啤酒的定律（公式2）和已知的消光系数（表1）的DNA浓度。
在微孔板中，该路径长度将根据井中的液体体积以及井的高度和尺寸（即96〜384孔板）而变化。为了获得可用于啤酒定律的数据，必须将吸光度结果标准化为1cm的路径长度（等式2中的B）。可以通过许多方法实现路径长度校正：
- 使用具有定义路径长度的酶标（例如LVIS板，Pathlength = 0.5mm）。拍摄OD测量，然后应用标准乘法值以实现1cm的路径长度。
- 使用PathLength校正功能在标准微孔板的软件中。使用的体积和微孔板在测试协议中指定，然后将算法应用于数据。
- 使用已知的水峰值校正以标准化数据。
使用水峰值校正的一个优点在于其他方法是，如果需要，可以为每个良好的允许将不同的体积分配到一个微孔板中的每个孔产生路径长度，更重要的是该方法还将校正样品制备期间可能发生的误差。
纯度确定
DNA样品可含有影响260nm的值的杂质。因此，建议还测量杂质最大吸光度的波长：
1.蛋白质污染（280nm）
2.酚酸盐污染，硫氰酸酯（230nm）
3.颗粒引起的光散射（340nm）
共同纯度检查是计算260/280的比率以寻找蛋白质污染。纯DNA给出1.8-2.0的比率，而纯RNA显示〜2.0。高质量样本应高于1.7。另一个常用的步骤是通过在260或280nm的OD值中从OD值中减去340nm的OD值来校正散射光的OD值，这大大降低了标准偏差并增加了测量的灵敏度。
材料与方法
- UV-Cuvettes从品牌半微米半微米
- 来自Greiner的UV星级96孔板
- 黑色384孔叶片μclect，COC来自Greiner的UV底部
- 光谱纳米配备兰维斯板
通过正态分布通道获得鲱鱼精子DSDNA和HPLC级水。
成绩与讨论
使用旱地板的DNA测量
LVIS板是一种特殊的微孔板，其含有16位点，适用于测量2μL样品。在溶液板上脱针井上的微量滴后，盖子被关闭，导致所有16个位点产生0.5mm的路径长度。用于使用LVIS板的测量的DSDNA标准曲线如图1所示。1。
灵敏度值（LOD）将取决于可以测量空白的可靠性。将LVIS板的DNA敏感性计算为<2μg/ mL。
使用标准微孔板进行DNA测量
在微孔板中，当使用最高的体积产生更长的路径长度时，可以实现最佳灵敏度。这通常是可以的，但如果样本是有限的，则用户通常希望使用尽可能低的音量。因此，有必要在体积和灵敏度之间找到最佳折衷。表2显示了在不同微孔板中为不同体积获得的检测限。表2中呈现的数据还表明，校正340nm的数据通常导致更高的灵敏度。
表2：96孔和384孔板中的DSDNA敏感性。
| 板式格式 | 体积 | 基于a的μg/μl260. | 基于a的μg/μl260.-一种340. |
| 96. | 350μl. | 0.39 | 0.24 |
| 96. | 300μl. | 0.22 | 0.20 |
| 96. | 200μl. | 0.45 | 0.36 |
| 96. | 100μl. | 1.03 | 0.82 |
| 96. | 50μl. | 1.3 | 1.3 |
| 384. | 20μl. | 1.9 | 0.53 |
| 384. | 5μl. | 2.8 | 2.4 |
| 384. | 3μl. | 2.7 | 2.4 |
使用比色皿的DNA测量
如果需要确定有限数量的样品，则在实验室中测量比色皿中的DNA含量仍然是常见的。比色皿测量具有优点，即所得的吸光度值已经标准化为1cm。图。图2显示了比色皿中的DSDNA测量结果。
如图2所示，在比色皿中实现了低DNA浓度范围的高线性度（R2 = 0.9999）。空白校正和一个260.- 一种340.建议使用参考以获得最高灵敏度（<0.2μg/ ml）。
结论
使用Spectrastar测量DNA样品有不同的可能性纳米。如果有足够的DNA材料并且只有几个应该测量的样品，则可以进行比色皿测量。对于较高的产量，应使用酶标蛋白。如果样品体积非常有限，则建议使用LVIS板，因为它提供了很大的线性范围，因此需要高灵敏度和仅需要2μL样品。
