使用吸光度(A260)和荧光方法(Qubit™和Quant-iT™/PicoGreen™)进行DNA定量

介绍

双链DNA不仅拥有构建人类所需的所有信息，而且是一种受欢迎的研究分子。无论是用PCR检测的表达水平或感染，还是用下一代测序产生序列信息并检测致病突变。基于DNA的方法需要对DNA进行定量:在这里，我们提出了基于吸光度或荧光的常用方法来定量所有浓度、体积和任何吞吐量下的DNA。

材料与方法

• 384井UV - 透明（Greiner＃781801）
• 黑色384 well small volume (Greiner #784076)
• 德赢vwin
• www.v66088.com 那FLUOstarω(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)
• 量子比特™dsDNA BR (ThermoFisher #Q32850)
• 量子比特™dsDNA HS (ThermoFisher #Q32854)
• Quant-it™Picogreen™（Thermofisher＃P11469）
• Lambda DNA（Thermofisher＃SD0011）
• 烤肉^®Stock 100x TE and H2O (Carl Roth)

实验程序
Lambda DNA在1x TE缓冲液中稀释至1 pg/ml至130µg/ml。将DNA以1:10稀释于工作液中进行量子比特BR和量子比特HS测定。对96孔板，20µl DNA与180µl染料溶液混合，对384孔板，2µl DNA与18µl染料溶液混合。在Quant-iT/PicoGreen试验中，DNA与工作液按1:1混合。96孔中加入100µl的染料和100µl的DNA, 384孔中加入10µl的每种溶液。吸光度法采用DNA，体积分别为100µl、50µl和2µl，分别置于96孔、384孔或LVis板中。

所有测量都是重复三次，空白测量重复12次。

仪器的设置

吸光度(预定义协议dsDNA)
光学设置	吸光度、端点
	谱1纳米分辨率	220 - 360纳米
一般设置	闪烁次数22
	设定时间0.2 s (384)
	定位时间0.5 s (96)

荧光强度，CLARIOstar Plus
光学设置	吸光度、端点
	单色仪	FITC默认值 励磁483 - 14 汽车二向色性 排放530 - 30
一般设置	闪光次数20次
	建立时间0.2 s
开始设置	专注:自动对焦
	动态范围:功能

荧光强度，欧米茄
光学设置	吸光度、端点
	过滤器	激励:485 排放：520
一般设置	闪光次数20次
	建立时间0.2 s
开始设置	增益调节		在最高标准，目标值90％

结果与讨论

基于吸光度的dsDNA定量德赢vwin官网客服多模微型板块的读者使用UltraFast UV / Vis光谱仪获得吸光度光谱。DNA光谱可以使用不同的平板格式以2-100μl的体积测量。通过MARS分析软件自动分析所得吸光光谱。在DNA浓度旁边，它计算A260 / A A280比率以确定蛋白质污染（图1）。

DNA定量荧光技术
使用荧光染料来定量DNA的原因是，与吸收相比，荧光染料更具特异性，可以检测较低的DNA浓度。在这里，我们比较了三种常用染料:Qubit高灵敏度和低灵敏度试剂盒和Quant-iT PicoGreen dsDNA定量试剂盒。所有的套件都根据使用说明和相同的标准进行测量。

检测后，数据被评估火星分析软件。它计算出未知量的浓度，平行于标准曲线测量。图3比较了三种测定方法的结果和浓度范围。它显示了Quant-iT和Qubit HS套件覆盖大的浓度范围，并对低DNA浓度敏感。量子比特BR试剂盒覆盖高DNA浓度。

版面格式和读者类型的比较
此外，针对所有三种测定套件和吸光度法计算检测极限。检测极限是空白值的浓度加上12个空白的标准偏差的三倍（平均坯料+ 3 * sdblank）。结果显示在表1和图4中。从试剂盒规格中取出最大可测量的荧光染料浓度。