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使用吸光度(A260)和荧光方法(Qubit™和Quant-iT™/PicoGreen™)进行DNA定量

安德里亚·克拉姆 德赢vwin官网客服BMG Labtech GmbH,77799 Ortenberg,德国 10/2020
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH多模读卡器与普通读卡器兼容DNA量化方法
  • 双链DNA的定量与数百个样本并行
  • 每井检测到0.8pg双链DNA

表的内容

介绍

双链DNA不仅拥有构建人类所需的所有信息,而且是一种受欢迎的研究分子。无论是用PCR检测的表达水平或感染,还是用下一代测序产生序列信息并检测致病突变。基于DNA的方法需要对DNA进行定量:在这里,我们提出了基于吸光度或荧光的常用方法来定量所有浓度、体积和任何吞吐量下的DNA。


材料与方法

  • 384井UV - 透明(Greiner#781801)
  • 黑色384 well small volume (Greiner #784076)
  • 德赢vwin
  • www.v66088.com FLUOstarω(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)
  • 量子比特™dsDNA BR (ThermoFisher #Q32850)
  • 量子比特™dsDNA HS (ThermoFisher #Q32854)
  • Quant-it™Picogreen™(Thermofisher#P11469)
  • Lambda DNA(Thermofisher#SD0011)
  • 烤肉®Stock 100x TE and H2O (Carl Roth)

实验程序
Lambda DNA在1x TE缓冲液中稀释至1 pg/ml至130µg/ml。将DNA以1:10稀释于工作液中进行量子比特BR和量子比特HS测定。对96孔板,20µl DNA与180µl染料溶液混合,对384孔板,2µl DNA与18µl染料溶液混合。在Quant-iT/PicoGreen试验中,DNA与工作液按1:1混合。96孔中加入100µl的染料和100µl的DNA, 384孔中加入10µl的每种溶液。吸光度法采用DNA,体积分别为100µl、50µl和2µl,分别置于96孔、384孔或LVis板中。


所有测量都是重复三次,空白测量重复12次。

仪器的设置

吸光度(预定义协议dsDNA)
光学设置 吸光度、端点
谱1纳米分辨率 220 - 360纳米
一般设置 闪烁次数22
设定时间0.2 s (384)
定位时间0.5 s (96)

荧光强度,CLARIOstar Plus
光学设置 吸光度、端点
单色仪 FITC默认值
励磁483 - 14
汽车二向色性
排放530 - 30
一般设置 闪光次数20次
建立时间0.2 s
开始设置 专注:自动对焦
动态范围:功能

荧光强度,欧米茄
光学设置 吸光度、端点
过滤器 激励:485
排放:520
一般设置 闪光次数20次
建立时间0.2 s
开始设置 增益调节 在最高标准,目标值90%

结果与讨论

基于吸光度的dsDNA定量德赢vwin官网客服多模微型板块的读者使用UltraFast UV / Vis光谱仪获得吸光度光谱。DNA光谱可以使用不同的平板格式以2-100μl的体积测量。通过MARS分析软件自动分析所得吸光光谱。在DNA浓度旁边,它计算A260 / A A280比率以确定蛋白质污染(图1)。

DNA定量荧光技术
使用荧光染料来定量DNA的原因是,与吸收相比,荧光染料更具特异性,可以检测较低的DNA浓度。在这里,我们比较了三种常用染料:Qubit高灵敏度和低灵敏度试剂盒和Quant-iT PicoGreen dsDNA定量试剂盒。所有的套件都根据使用说明和相同的标准进行测量。


检测后,数据被评估火星分析软件。它计算出未知量的浓度,平行于标准曲线测量。图3比较了三种测定方法的结果和浓度范围。它显示了Quant-iT和Qubit HS套件覆盖大的浓度范围,并对低DNA浓度敏感。量子比特BR试剂盒覆盖高DNA浓度。

版面格式和读者类型的比较
此外,针对所有三种测定套件和吸光度法计算检测极限。检测极限是空白值的浓度加上12个空白的标准偏差的三倍(平均坯料+ 3 * sdblank)。结果显示在表1和图4中。从试剂盒规格中取出最大可测量的荧光染料浓度。

表1。基于微孔板的DNA定量方法在样本体积和最小DNA输入方面的比较(针对CLARIOstar Plus)

方法 样本量 最低DNA输入
A260 LVIS. 2µl 5000 pg
A260 96年好 100μl. 33000 pg.
A260 384年好 50µl 10500 pg
QubitHS 96年好 1 -µl 3.4 pg
QubitHS 384好了sv 0.1 - 2µl 0.8 pg
量子位BR 96年好 1 -µl 70 pg
量子位BR 384好了sv 0.1 - 2µl 13.6 pg
Quant-iT / PicoGreen 96年好 100μl. 3.5 pg
Quant-iT / PicoGreen 384好了sv 10µl 2.3 pg

结论

德赢vwin官网客服微型板块的读者可靠地检测双链DNA。该仪器可对任何样品浓度和体积进行定量。以上数据可以帮助您找到适合您需要的仪器和量化方法。

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