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使用吸光度(A260)和荧光方法(Qubit™和Quant-IT™/ PicoGreen™)进行DNA定量

andrea krumm. 德赢vwin官网客服BMG Labtech GmbH,77799 Ortenberg,德国 10/2020
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech多模板读卡器与常见兼容DNA量化方法
  • 用数百个并联的双链DNA定量
  • 每井检测到0.8pg双链DNA

介绍

双链DNA不仅拥有构建人类的所有信息,而且还是一个流行的学习分子。通过PCR测量的表达水平或感染,或下一代测序以产生序列信息和检测负责疾病的突变。基于DNA的方法需要定量DNA:这里我们呈现基于吸光度或荧光的常用方法,以定量所有浓度,体积和任何产量的DNA。


材料与方法

  • 384井UV - 透明(Greiner#781801)
  • 黑色384小卷(Greiner#784076)
  • 德赢vwin
  • www.v66088.com Fluostar omega.(德赢vwin官网客服BMG Labtech)
  • Qubit™DSDNA BR(Thermofisher#Q32850)
  • Qubit™DSDNA HS(Thermofisher#Q32854)
  • Quant-it™Picogreen™(Thermofisher#P11469)
  • Lambda DNA(Thermofisher#SD0011)
  • Roti.®库存100x te和h2o(卡尔罗斯)

实验程序
将Lambda DNA在1x TE缓冲液中稀释至浓度,浓度在1pg / ml和130μg/ ml之间。通过在工作溶液中稀释DNA 1:10来进行Qubit BR和Qubit HS测定。对于96个孔板,将20μLDNA与180μl染料溶液混合,对于384孔板,将2μlDNA与18μL染料溶液混合。在Quant-IT / PicoGreen测定中,DNA和工作溶液混合1:1。填充96个板孔,填充100μl染料和100μlDNA,384孔,每种溶液为10μl。基于吸光度的测量,将DNA的载体和100μl,50μl和2μl的体积分别置于96孔,384孔或溶液板中。


所有测量均以三倍一一次进行,12个重复空白测量。

仪器设置

吸光度(预定义的协议DSDNA)
视镜设置 吸光度,终点
光谱1nm分辨率 220-360 nm.
常规设置 闪光数22
建立时间0.2 s(384)
建立时间0.5 s(96)

荧光强度,Clariostar Plus
视镜设置 吸光度,终点
单色仪 FITC默认值
激励483-14
自动二向号
发射530-30.
常规设置 闪光数20
建立时间0.2 s
开始设置 焦点:自动对焦
动态范围:EDR

荧光强度,Flyostar omega
视镜设置 吸光度,终点
过滤器 刺激:485
排放:520
常规设置 闪光数20
建立时间0.2 s
开始设置 获得调整 在最高标准,目标值90%

成绩与讨论

基于吸光度的DSDNA定量BMG LABTECH德赢vwin官网客服多模微孔板读卡器使用UltraFast UV / Vis光谱仪获得吸光度光谱。DNA光谱可以使用不同的平板格式以2-100μl的体积测量。通过MARS分析软件自动分析所得吸光光谱。在DNA浓度旁边,它计算A260 / A A280比率以确定蛋白质污染(图1)。

基于荧光的DNA定量
使用用于定量DNA的荧光染料,因为与吸收相比,它们更具体并检测降低DNA浓度。在这里,我们将三种常用的染料进行了比较:Qubit高灵敏度和低灵敏度套件和Quant-IT PicoGreen DSDNA定量套件。所有套件都根据使用说明和相同的标准测量。


检测后,数据被评估火星分析软件。它计算了与标准曲线平行测量的未知数的浓度。在图3中比较了三种测定的结果和浓度范围。它显示了覆盖大浓度范围并且对低DNA浓度敏感的量子和Qubit HS试剂盒。Qubit Br套件涵盖高DNA浓度。

板式格式和读卡器类型的比较
此外,针对所有三种测定套件和吸光度法计算检测极限。检测极限是空白值的浓度加上12个空白的标准偏差的三倍(平均坯料+ 3 * sdblank)。结果显示在表1和图4中。从试剂盒规格中取出最大可测量的荧光染料浓度。

表1.对样品体积和最小DNA输入的基于微孔板的DNA定量方法的比较(用于Clariostar Plus)

方法 盘子 样本量 最小DNA输入
A260 LVIS. 2μl. 5000 pg.
A260 96好吧 100μl. 33000 pg.
A260 384嗯 50μl. 10500 pg.
Qubiths. 96好吧 1-20μl. 3.4 pg.
Qubiths. 384井sv. 0.1-2μl. 0.8 pg.
qubit br. 96好吧 1-20μl. 70 pg.
qubit br. 384井sv. 0.1-2μl. 13.6 pg.
Quant-It / Picogreen 96好吧 100μl. 3.5 pg.
Quant-It / Picogreen 384井sv. 10μl. 2.3 pg.

结论

德赢vwin官网客服微孔板读者可靠地检测双链DNA。该仪器涵盖了任何样品浓度和体积的定量。上面显示的数据有助于找到适合您需求的正确仪器和量化方法。

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