使用吸光度（A260）和荧光方法（Qubit™和Quant-IT™/ PicoGreen™）进行DNA定量

介绍

双链DNA不仅拥有构建人类的所有信息，而且还是一个流行的学习分子。通过PCR测量的表达水平或感染，或下一代测序以产生序列信息和检测负责疾病的突变。基于DNA的方法需要定量DNA：这里我们呈现基于吸光度或荧光的常用方法，以定量所有浓度，体积和任何产量的DNA。

材料与方法

• 384井UV - 透明（Greiner＃781801）
• 黑色384小卷（Greiner＃784076）
• 德赢vwin
• www.v66088.com 那Fluostar omega.（德赢vwin官网客服BMG Labtech）
• Qubit™DSDNA BR（Thermofisher＃Q32850）
• Qubit™DSDNA HS（Thermofisher＃Q32854）
• Quant-it™Picogreen™（Thermofisher＃P11469）
• Lambda DNA（Thermofisher＃SD0011）
• Roti.^®库存100x te和h2o（卡尔罗斯）

实验程序
将Lambda DNA在1x TE缓冲液中稀释至浓度，浓度在1pg / ml和130μg/ ml之间。通过在工作溶液中稀释DNA 1:10来进行Qubit BR和Qubit HS测定。对于96个孔板，将20μLDNA与180μl染料溶液混合，对于384孔板，将2μlDNA与18μL染料溶液混合。在Quant-IT / PicoGreen测定中，DNA和工作溶液混合1：1。填充96个板孔，填充100μl染料和100μlDNA，384孔，每种溶液为10μl。基于吸光度的测量，将DNA的载体和100μl，50μl和2μl的体积分别置于96孔，384孔或溶液板中。

所有测量均以三倍一一次进行，12个重复空白测量。

仪器设置

吸光度（预定义的协议DSDNA）
视镜设置	吸光度，终点
	光谱1nm分辨率	220-360 nm.
常规设置	闪光数22
	建立时间0.2 s（384）
	建立时间0.5 s（96）

荧光强度，Clariostar Plus
视镜设置	吸光度，终点
	单色仪	FITC默认值 激励483-14 自动二向号 发射530-30.
常规设置	闪光数20
	建立时间0.2 s
开始设置	焦点：自动对焦
	动态范围：EDR

荧光强度，Flyostar omega
视镜设置	吸光度，终点
	过滤器	刺激：485 排放：520
常规设置	闪光数20
	建立时间0.2 s
开始设置	获得调整		在最高标准，目标值90％

成绩与讨论

基于吸光度的DSDNA定量BMG LABTECH德赢vwin官网客服多模微孔板读卡器使用UltraFast UV / Vis光谱仪获得吸光度光谱。DNA光谱可以使用不同的平板格式以2-100μl的体积测量。通过MARS分析软件自动分析所得吸光光谱。在DNA浓度旁边，它计算A260 / A A280比率以确定蛋白质污染（图1）。

基于荧光的DNA定量
使用用于定量DNA的荧光染料，因为与吸收相比，它们更具体并检测降低DNA浓度。在这里，我们将三种常用的染料进行了比较：Qubit高灵敏度和低灵敏度套件和Quant-IT PicoGreen DSDNA定量套件。所有套件都根据使用说明和相同的标准测量。

检测后，数据被评估火星分析软件。它计算了与标准曲线平行测量的未知数的浓度。在图3中比较了三种测定的结果和浓度范围。它显示了覆盖大浓度范围并且对低DNA浓度敏感的量子和Qubit HS试剂盒。Qubit Br套件涵盖高DNA浓度。

板式格式和读卡器类型的比较
此外，针对所有三种测定套件和吸光度法计算检测极限。检测极限是空白值的浓度加上12个空白的标准偏差的三倍（平均坯料+ 3 * sdblank）。结果显示在表1和图4中。从试剂盒规格中取出最大可测量的荧光染料浓度。