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GPCRs中检测配体偏置的双通道动力学分析

保罗·陶森(1)斯科特·马丁卡(1)凯文·m·哈伦(1)汤姆·休斯(1)安妮·玛丽·奎因(1)萨姆·R.J.霍尔(2)卡尔·彼得斯(3) (1) Montana Molecular, Bozeman, MT (2) Pharmechanics, Owego, NY (3) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH Inc., NC, USA 11/2019
  • 遗传编码,单色荧光生物传感器检测活细胞中的β-抑制素信号
  • β-Arctionin传感器与GQ传感器复用同时检测诱导和G蛋白信号传导
  • Clariostar诱导和G蛋白信号传导的动力学分析®可靠地检测激动剂偏见

介绍

活化的G-蛋白偶联受体(GPCR)可以通过G蛋白和抑制途径发出。一些配体偏向受体朝向信号传递通过一个或其他途径,这可以影响下游蜂窝效应1。例如,血管紧张素II型(AT1R)受体的诱导偏置激动剂减少动脉压,增加心脏能,而无偏的或G蛋白偏置配体未能改善心脏能2。需要更好的工具来可靠地识别和量化激动剂偏见,激发了我们在实时开发捕获来自β-Arcketin和G蛋白第二信使的信号的方法。来自每个途径的信号可以同时收集,并且具有高巧克力与BMG Labtech Clariostar板读数器。德赢vwin官网客服

测定原则

GPCR信号过程的时间模式可以影响偏激动性的检测和定量3.这些模式随不同的受体和激动剂而变化。然而,这种“动力学上下文”不存在标准端点测量。要随着时间的推移捕获第二信使信令响应,我们开发了红色和绿色潮日荧光生物传感器4、5对于β-Arcketin,营地,DAG,CA2+和点2。每个生物传感器都是由单个荧光蛋白构成的,当信号发生时荧光强度会发生变化。红色和绿色生物传感器可以结合在一个单一的试验中,同时测量抑制素和g蛋白介导信号在同一细胞群中的反应功能。我们将一种绿色的β-arrestin生物传感器与一种红色DAG传感器(R-GECO,一种红色的Ca生物传感器)结合在一起2+在表达血管紧张素受体AT1R的活细胞中。我们用已知的配体激活受体,并在BMG LABTECH CLARIOstar酶标仪上监测荧光强度。德赢vwin官网客服


材料与方法

  • HEK293T细胞
  • 蒙大拿分子绿色β-Arcuctin传感器,红色DAG传感器和R-GECO钙传感器。
  • Greiner Cellcoat 96-孔微孔板,黑色,μtol底部(猫。美国专利号655946)1
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech Clariostar Microplate Reader
  • 血管紧张素II和Trevena肽TRV120026、TRV120045、TRV120055均来自GenScript。SII来自MyBioSource。

实验的程序
传感器表达:将HEK293T细胞与携带上述传感器的BacMam载体悬浮液转导,并置于96孔板中。24小时后,交换细胞培养液为DPBS,室温放置30分钟,再加药。


药物添加和剂量响应:所有实验都要进行基线荧光测量,之后取出平板,使用电子多通道吸管添加药物。在药物添加后立即测量荧光强度的变化,并在几分钟内捕获每个fi - ve ATR1配体的响应函数。


仪器的设置

视镜设置 底光学荧光强度
单色仪设置 β-Arcketin传感器(Alexa 488预设)

例:488 - 14所示

二向色:自动

EM:535-50.

增加:从新加坡。2500

Red DAG或R-GECO Ca2+传感器

前:566-18

二向色:自动

新兴市场:620 - 40

增加:从新加坡。2800

通用设置 闪光次数: 40
设置时间: 0
动力学设置 周期: 42-205
孵化 25℃

成绩与讨论

在BMG Clariostar上捕获β-Arcketin响应在几分钟内捕获,并通过荧光强度的稳健变化和0.92(图2)的Z'值表示。用两个AT1激动剂进行剂量反应测量,产生可靠的EC50.值(图3)。

五个AT1R受体激动剂(30μm)产生不同的β-ARRESTIN,DAG和CA2+随时间变化的响应函数(图4)。对每个配体的响应函数的动力学分析可以用来可靠地评估激动剂的偏倚6


结论

β-抑制素和g蛋白信号的荧光生物传感器检测可以结合在活细胞中,并在BMG LABTECH CLARIOstar上以前所未有的精度监测。德赢vwin官网客服具有线性可变滤波器(LVF)单色的光路提供灵敏度和带宽的灵活性,是理想的检测基因编码荧光生物传感器。

参考资料

1.史密斯,S等人。2018. NAT。Rev. Dist Disc.17:243-260。
2.小提琴,J等2010。JPET 335(3): 572-579。
3.Herenbrink, K.C.等人,2016。7, p.10842。
4. Tewson,P.等人。2012. Plos One,7(8),P.E42791。
5.Tewson P.等人,2018年。“sla管理”,26 (9),pp. 988 - 906。
6.Hoare, s.r.j等,2019。doi.org/1011101/772293

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