172.

双荧光素酶测定以评估丙型肝炎病毒亚基核科学复制子的复制

莎拉·格雷顿,马克·哈里斯 利兹生物科学学院 09/2008
  • DLRTM值用于监测丙型肝炎病毒早期复制事件的试验
  • 对DLR进行的测量TM值CETII FIE德赢vwin官网客服D BMG LABTECH介质读卡器
  • 可以容易地检测到潜在的抑制剂

表的内容

介绍

丙型肝炎病毒(HCV)是一个影响全球估计1.7亿人的全球健康问题。慢性感染可导致肝硬化的发育导致终级肝功能衰竭或肝细胞癌。HCV没有疫苗,目前的疗法仅在左右50%的人中有效。因此,需要改善对筛选潜在病毒抑制剂的病毒生命周期和系统的理解。


亚基因组复制子系统的开发,只编码RNA复制所需的病毒非结构蛋白,允许研究病毒的复制,而无需释放感染性颗粒和必要的封闭设施。最近,从高效复制的基因型2a型HCV株(JFH1)中生成了一个亚基因组复制子,将萤火虫荧光素酶基因纳入到HCV内部核糖体进入位点元件的控制下。


这使得在没有任何选择性压力的情况下,允许监测HCV的早期复制事件,并进一步调查化合物对这些事件的影响。


本申请说明描述了一种方法,用于直接在HCV的RNA复制同时评估潜在抑制剂的影响,以及使用BMG Labtech微孔板读取器的人肝癌细胞的总体翻译。德赢vwin官网客服作为细胞中整体翻译的指示,使用来自PRLTK质粒的盖RNA转录物。这种质粒含有一个Renilla荧光素酶基因,前面是T7启动子。

材料与方法

  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读者带注射器
  • MEGAscript®T7套件,AMBION(应用生物系统)
  • Cap模拟(m7G(5 ')ppp(5 ')G), Ambion(应用生物系统)
  • Bio-rad基因脉冲钳Xcell真核系统电孔器
  • 基因脉冲/微量潜水器比色皿,0.4cm间隙,Bio-rad

此外,根据各种制造商的需要使用组织培养物品,移液管尖端等。


双荧光素酶复制和翻译试验
在体外转录的(IVT)复制子RNA由JFH1荧光素酶亚基金属组(SGR-JFH1-LUC)DNA的线性化模板制成,使用巨型版本®T7工具包。线性化pRLTK质粒DNA的体外转录如上所述,但存在cap类似物。400万PBS洗涤的人肝癌(Huh-7.5)细胞在0.4 cm试管中电穿孔,同时加入5 μg SGR-JFH1-Luc RNA和5 μg RTLK RNA,电压为270 V, 950 μF。


然后将细胞重悬于标准细胞培养基中并在96个孔板中以每孔1000个细胞的密度接种。将细胞在37℃下以正常孵育。通过小心地除去培养基并在PBS中仔细取出培养基并在加入20μl1×被动裂解缓冲液(Promega)中进行两次,并放置在摇摆平台(温和摇摆中,以确保甚至覆盖细胞单层覆盖)在室温下15分钟。


然后将含有裂解细胞的96孔板保存在-20°C(最多保存一个月)或使用以下参数直接在酶标仪中读取:

读取模式: 发光,井模动力学
定位延迟: 0.2秒
测量开始时间: 0.0秒
没有间隔: 48.
发射过滤器: 空/镜头(取决于读者)
推荐收益: 3800.
注射速度: 260μl/秒
注塑开始时间: 1和13秒



对于数据计算,相对发光单元平均在两个范围内:


范围1 -火佛罗里达州发光(循环5-26或2 -12.5秒)
范围2 -Renilla发光(周期29-48秒或14-23.5秒)

结果与讨论

图1为实验的典型信号曲线。

在电穿孔后4,8和24小时收获细胞,并分析火佛罗里达州Renilla荧光素酶活性。读取4小时的读数允许建立RNA的输入水平(图2和3)。

第一翻译输入SGR-JFH1-Luc RNA发生4 - 8小时,然而,8至24小时内的荧光素酶水平增加了6倍,表明野生型复制子RNA的复制,复制缺陷突变体的对比与荧光素酶水平(接地),显示荧光素酶活性下降后8小时(图2)。翻译RLTK RNA发生在24小时时间内,但由于缺乏复制和RNA的降解,荧光素酶信号随时间下降(图3)。然而,信号可在24小时后检测到,以便对细胞翻译进行评估。

为了评估各种化合物对复制而不是翻译的影响,将电穿孔后8小时加入化合物,并将细胞再孵育16小时。在4小时内收获未处理的细胞(输入RNA的标准化),在24小时内收获处理和未处理的细胞以检测对复制的影响(数据未显示)。

结论

该试验允许评估化合物对早期复制事件和细胞翻译的影响。96孔板格式允许多种不同浓度的化合物同时针对单个电穿孔产生的细胞进行测试。


在BMG LABTECH酶标仪上成功地进行了检测。德赢vwin官网客服所有具有德赢vwin官网客服发光检测和注入器的BMG LABTECH微孔板读卡器都获得了Promega的双荧光素酶报告基因(DLRTM值)基因测定。

去前