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双荧光素酶报告基因(DLR)检测认证

ej戴尔卡尔彼得斯 德赢vwin官网客服 12/2014
  • Promega公司的DLR试验已经在Omega, CLARIOstar上验证过了®和本百合点®FSmicroplate读卡器来自BMG LABTE德赢vwin官网客服CH

介绍

的Dual-Luciferase®报告基因法(DLR)被广泛应用于研究基因转录与调控。DLR试验是两步反应,使用两种荧光素酶,萤火虫和Renilla(图1)。萤火虫反应开始,接着是它的猝灭和随后的启动Renilla的反应。


这两种酶的双重测量允许在同一时间进行实验测量和转染控制测量。这种对每个样本的双重报告允许基于标准化的定量结果Renilla荧光素酶(转染控制)。有关DLR检测及其认证要求的更多信息,请访问Promega的网站www.promega.com在技术手册里也有。

认证过程包括3个部分:淬火、一致性和油管吸附。


第一个标准是淬火实验。这将表示停止和glo®注射步骤2中加入的试剂成功淬灭注射步骤1中加入的荧光素酶检测试剂II引发的萤火虫荧光素酶反应。第二个标准是一致性实验。这些实验确定了在两种不同浓度的萤火虫和,仪器是否能保持相对标准偏差小于5% (%CV)Renilla荧光素酶。管道吸附实验是第三标准。该实验表明仪器注射器中使用的管道是否会对DLR测定产生影响。


这三个实验都是在北极星上进行的®, FLUOstar®和LUMIstar®欧米茄以及克拉罗星和pherstarFS获得了DLReady™认证。

测定原则

双荧光素酶测定是一种快速反应,有两个注射步骤,一个用于萤火虫底物(荧光素酶测定试剂II或LAR II),一个用于停止和Glo®缓冲器里面有萤火虫猝灭器和Renilla底物(图2)。

反应需要注射和测量12秒(以定量萤火虫的发光),然后再注射和另一个12秒的测量(以定量Renilla荧光素酶)。


材料与方法

  • 白色平底96口井的合演®盘子
  • Promega的DLR认证套件
  • 重组火焰和Renilla荧光素酶由Promega提供

仪器的设置

ω系列 CLARIOstar PHERAstarFS
检测模式 发光
方法 井模动力学,顶部光学
光学设置 排放:镜头 排放:
全系列
或单色仪
(520 - 620nm)
发光

模块
定位延迟 0.2秒
的时间间隔 48 Inverval
温val时间 0.5秒
注塑开始时间 0和12秒
注射速度 220或230μl/秒

这些实验按照Promega仪器认证文档中的描述进行。每个测试与将工具包作为一个整体运行略有不同。这3个认证标准都是按照Promega的指导方针执行的。


为了计算数据,将相对发光单位在两个范围内相加:

  • 范围1 -萤火虫发光(3.0-12秒)。
  • 范围2 -Renilla发光(14.5 - -23.5秒)。

成绩与讨论

判据1:>淬火10000只萤火虫/Renilla

重组FIR y Luciferase表现出淬火,即10,000倍(DLR要求)(图3)。这是通过划分空白校正的尼郎发光的空白校正的火焰发光来计算(在该实验中没有使用Renilla)。

标准2:一致性显示< 5%的CV
对于准则2,一只15倍的萤火虫Renilla第一部分使用荧光素酶浓度,第二部分使用30 X Renilla to Firefly浓度。所有测试的BMG LABTECH仪器的%CV值都低于5%。德赢vwin官网客服


表1:标准2 -一致性必须< 5%。

%CV, n = 24 一致性Part1 第二部分的一致性
萤火虫 Renilla 萤火虫 Renilla
ω系列 2.3 2.5 2.2 2.0
CLARIOstar 2.0 1.5 0.5 2.3
PHERAstarFS 1.5 1.8 1.6 0.6

标准3:10分钟后,油管吸附显示< 5% CV
类似准则2第一部分;15 X萤火虫到Renilla用于该测试。运行十二次复制,然后12个重复,介入10分钟等待测试可能的管道吸附。与其他测试一样,%CVS小于3,因此在标准内明显(表2)。


表2:判据3 -管材吸附10分钟后变化不大,n=12。

ω 萤火虫 Renilla
平均 %的简历 平均 %的简历
RLU 1.055 e7 2.5 3.711 e6 1.8
RLU(10分钟后) 1.030 e7 1.9 3.793 e6 2.5
CLARIOstar 萤火虫 Renilla
平均 %的简历 平均 %的简历
RLU 7.006 e6 0.7 1.768 e5 1.4
RLU(10分钟后) 6.91 e6 0.5 1.762 e5 2.0
PHERAstarFS 萤火虫 Renilla
平均 %的简历 平均 %的简历
RLU 1.552 e7 1.5 8.925 e5 1.7
RLU(10分钟后) 1.536 e7 1.1 1.536 e7 1.8

结论

Omega系列的微孔板阅读器以及克拉罗星和pherstarFSBMG L德赢vwin官网客服ABTECH根据本申请说明中公布的结果获得了DLReady™认证。

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