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艾尔曼溶液中巯基定量测定法

Rucha Bhat Gregory Gregory Grover,PHD Contraline Inc.,夏洛茨维尔,弗吉尼亚州 11/2018
  • 光谱纳米每井不到一秒钟捕获光谱数据
  • 光谱允许测定等静点作为试剂和样品之间等效性的指标
  • 光谱纳米测定常用测定硫醇基团的方法

介绍

Ellman试剂为5,5′-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸),也称DTNB,是用于定量溶液中游离巯基的化合物(图1)。该化合物的溶液与巯基反应生成黄色产物。这种黄色的产品可以通过分光光度计在412 nm处的强吸光度来定量(1,2)

硫醇化学是一种迅速扩展的基础和应用的生物科学。因此,-SH组的定量测量是许多应用学科中的常规任务,其中一个快速简便的方法是更优选的3.。电化学和荧光分析是非常敏感和准确的,但他们涉及冗长的程序(完全的蛋白质水解,电解,高效液相色谱分离)。虽然像Ellman 's这样的硫醇分光光度法的灵敏度较低,但它们快速、简单,因此在巯基的定量中更受欢迎。


测定原则

DTNB与游离巯基反应生成混合二硫化物和2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB;在这个反应中,DTNB的目标是一个游离巯基的共轭碱(R-S -)。TNB是这种反应中产生的“有色”物种,在可见范围内有很高的摩尔消光系数。在412 nm, pH 8.0条件下,TNB的摩尔消光系数为13600 M-1cm-1。

通过与含有巯基的化合物(如半胱氨酸)的已知浓度组成的标准曲线进行比较,可以估计样品中的巯基。或者,巯基可以通过参考TNB的消光系数来定量。


材料与方法

  • 平底96孔板(Nunc)
  • 光谱纳米
  • 反应缓冲液(RB):0.1M磷酸钠,pH8.0,含有1mM EDTA
  • 盐酸半水合物(MW 175.6)Ellman的试剂5,5-二硫代 - 双(2-硝基苯甲酸)

实验的程序

使用前将艾尔曼试剂和半胱氨酸解冻至室温。将4 mg解冻后的Ellman试剂溶解于1 mL RB中制备Ellman试剂溶液。

  • 将盐酸一水半胱氨酸溶解在RB中制成标准A (1.6 mM)。将a标准品稀释2倍至0.1 mM,制备一套半胱氨酸标准品。
  • 至少准备2倍1:10稀释的未知物。
  • 准备一套试管,每管含有50µL Ellman试剂溶液和2.5 mL RB
  • 在步骤3中制备的单独的试管中加入250μl或未知。
  • 在室温下混合并孵育15分钟。向96孔板中加入200μl每种溶液。
  • 使用Spectrastar.纳米采取化合物的全吸光光谱

仪器的设置

光学设置 吸光度、端点
波长设置 光谱: 250-500 nm.
解决方法: 2
pathlength校正 打开,第250卷µl
速度和精度 精确

7.将获得的OD值绘制为412 nm的标准品,生成标准曲线。根据这条曲线,用下面的公式确定实验样品浓度。

成绩与讨论

半胱氨酸标准曲线

标准曲线本身可以作为测定方法强度的有效指标。通过取每个溶液的吸光度的全谱值,可以用表格或图形来确定等静点,以确定Ellman试剂和测试样品之间的摩尔比在每个测试溶液中是相等的。Ellman的等静点约为356nm(图3)。412nm处的平滑峰也表明您的溶液在检测的工作范围内。

计算未知溶液的巯基浓度

类似地,可以将未知溶液的吸光度光谱与标准曲线的吸光光谱进行比较,以确保溶液的浓度落入标准曲线的范围内(图4)。未知溶液A和B的吸光度值沿标准曲线绘制,对应于分别为1.234mm和0.810mm的巯基浓度(图5)。

结论

Ellman的测定是一种有用的工具,可用于确定未知解决方案的巯基浓度。该测定还可以适于通过使用啤酒的法律和TNB的消光含量,适应大量的测试样品进行比色皿中的读数。


艾尔曼的试剂可用于除溶液中巯基估计以外的应用。使用预柱衍生化方法通过HPLC测定烷硫醇,并在几种酶的活性位点中研究硫醇,包括硫醇酶脂肪酸合酶和甲戊酯5-二磷酸脱羧酶。还原化合物和样品/细胞使用。

参考资料

1. Thermo Scienti Fi C.(2011)。艾尔曼的试剂

2. iupac。化学术语纲要,第2章。(“金书”)。编译A.D. McNaught和A.

3. Riener,C.K.,Kada,G.,Gruber,H. J.(2002)。用Ellman的试剂和4,4'-二吡啶的蛋白质巯基的快速测量蛋白质巯基。分析和生物分析化学,373(4-5),266-276。

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