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用Live Cell动力学监测阐明Protac MoA对三元复合体形成和靶蛋白泛素

克里斯汀富豪艾米兰迪曼丹特丹德尔斯 Promega,Madison,Wi,U.S.A 04/2020
  • protac是一种新的治疗化合物,其靶向细胞蛋白质以降解
  • 需要验证PROTAC的功能和作用机理
  • 使用ACU的ClarioStar使用ACU监控Protac功能NanoBRET™Promega开发的三元复合物和泛素化测定。

介绍

蛋白水解靶向嵌合体(Protacs)是最近受到作为治疗方式的关注的小分子,并使用细胞蛋白质降解机制来靶向来自细胞的特定蛋白质1。Protacs通过通过通过化学接头连接的两个结合配体的作用直接与E3泛素连接酶直接与E3泛素连接酶进行靶蛋白来实现这一点在E3连接酶,protac和靶蛋白之间形成该诱导的三元络合物是靶向降解所需的第一机械步骤。生产性三元复合物将导致泛素化并最终降解蛋白质(图1)。Protacs作为治疗剂的可能性特别适用于调节疾病中有关的转录因子和非酶促蛋白质,其中小分子抑制剂已被证明是无效的。

虽然Protacs的承诺很高,但它们的设计和优化仍存在重大挑战。这包括特定方法采用的动作机制的表征,并理解需要改善哪些步骤以获得更有效的降级2。在这里,我们展示了如何www.v66088.com ACU可用于测量活细胞中的Nanobret TM信号,以评估Ternary复合物形成的动力学和Protac治疗后的靶蛋白泛素。为BRD4和BET系列PROTAC ARV-771提供示例性数据,其为VHL E3连接酶复合物重新招募BET系列蛋白质。

测定原则

BRD4用11个氨基酸肽,HIBIT标记,使用CRISPR / CAS9基因组编辑技术在稳定表达LGBit的细胞系中。Hibit和LGBit的高亲和力协会导致纳米杆的重建®荧光素酶与内源BRD4蛋白融合。然后可以通过表达荧光标记的卤素杆来监测Protac诱导的三元复合体或泛素化®融合到E3连接酶招生者或泛素(图2)。

材料与方法

  • www.v66088.com ACU(德赢vwin官网客服BMG Labtech)
  • 哈利塔®融合构建体和Nanobret™试剂(Promega)
  • HEK293细胞从美国型培养物收集获得
  • Protacs和其他化学品和试剂来自市售来源

实验的程序
有关完整的实验细节,请参阅Nanobret™协议,用于三元复合体和泛素化。CRISPR / CAS-9基因组编辑在HEK293细胞上稳定地表达LGBit以敲入HIBIT至BRD4。转染克隆细胞以表达卤橡胶棒®vhl或HaloTag®泛素融合蛋白。实验当天更换培养基,补充20µM Nano-Glo®Vivazine,延长的时间释放的基板。在37°C孵育1小时后,5%CO2,细胞用DMSO或ARV-771 PROTAC处理。使用带有ACU的CLARIOstar进行以下设置,收集动力学nanoobret™测量数据。

仪器设置

视镜设置 多色发光,板模式动力学
过滤器 460-80 / 610 LP
通用设置 建立时间 0.1秒
测量时间间隔 0.5秒
动力学设置 周期数 120(或63)
周期 180秒
孵化 有限公司2 5%

成绩与讨论

内源性标记的hibit-brd4细胞共同表达Hahotag®vhl或HaloTag®- 用浓度系列ARV-771 Protac治疗后,泛素显示快速和剂量依赖的三元复合体(图3)和泛素(图4)。VHL的三元复合复合形成在3小时内保持稳定,BRD4泛素突显在4小时内达到高原。在两个测定中,将基线上方的Nanobret TM信号下降到4nm ARV-771,展示高灵敏度和测定鲁棒性。

结论

我们展示了Nanobret™技术和Clariostar的应用,用ACU测量靶向蛋白质降解的关键步骤。用E3连接酶测量三元复合物形成的活细胞动力学以及毒性蛋白质的效率对PROTAC优化,确认MOA和理解降解疗效至关重要。两个测定可以与通过CRISPR / CAS9用Hibit标记的内源表达的靶蛋白结合使用,并且在检测在非常低浓度的PROTAC中检测事件的高灵敏度。这些工具可以进一步了解化学优化的策略,最终能够促使设计和开发高效的protac化合物。


参考资料

1.顾,s等人。Protacs:药物发现中蛋白质降解的新出现靶向技术。生物。(2018)40:1-11。
2.富裕,西临。等等。Protac作用模式的定量活细胞动力学降解与机械分析。ACS Chem。BIOL。(2018)13:2758-2770。

raina,k等人。Protac诱导的Bet蛋白质降解作为抗阉割前列腺癌的治疗。pnas。(2016)113:7124-7129。

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