- 假单胞菌使用ABZ-NBA内部淬火基板监测弹性蛋白酶活性
- K米和V.最大使用火星数据分析软件计算
- Michaelis Menten动力学测定了160个弹性蛋白酶抑制剂的图书馆
介绍
假单胞菌弹性蛋白酶(elastase, pseudolysin, LasB)是条件致病菌分泌的一种金属蛋白酶毒力因子铜绿假单胞菌。作为这种细菌的主要毒力因子之一,它有助于各种疾病状态从囊性纤维化肺的慢性和顽固感染,对皮肤的慢性溃疡有助于各种疾病状态。
LASb的中心作用使其成为该过程中的关键药物靶标,因此开发了一种抑制剂候选物文库以筛选酶。使用来自BMG LabTech的滤光片的微孔板读卡器进行测定,其允许高度适应的数据捕获和平行筛选多种化合物。德赢vwin官网客服数据直接在MARS软件内分析,从而提取了测定后数据的子集。
测定原则
测定原理如图1所示。

内部淬火的蛋白酶衬底Abz-肽-NEBA(2-氨基苯甲酰基 - 甘氨酸-Leu-Ala-4-硝基 - 苄基酰胺)仅提供低荧光信号。在用LASB结合的肽切割后,荧光供体基团不能将能量转移到猝灭受体基团,导致高荧光信号与酶活性直接相关。
材料与方法
- Abz-Ala-Gly-Leu-Ala-Nba(美国多肽国际)
- 贝尔法斯特皇后大学药学院合成的LasB抑制剂图书馆
动态测量
LasB以100 μg/mL原液配制,稀释1 in 1000,每孔10 μL,工作浓度为1 ng /孔。
K米首先通过测定一系列浓度为20μm至1000μm的一系列浓度来计算底物,抵抗固定浓度的LASb。
抑制剂研究
抑制剂的储备溶液在DMF中配制为10毫米,并在需要时进一步稀释。所使用的仪器设置如下:
不。每孔闪光次数:10次
目标温度:37℃
Ex滤镜:310/10 nm, Em滤镜:460/10 nm
在含有0.05M Tris HCl,2.5mM CaCl 2,1%DMF,pH 7.2的缓冲液中进行所有测定,横跨一系列抑制剂。
结果与讨论
结果可以在图2中可以看出,其次是水解速率Vs衬底浓度的图形显示(图3),以及图4的双倒数或线织机-Burk图。



在Lineweaver-Burk图上这条线的斜率为K米/ V最大,而x-拦截给出 - 1 / k米,以及y-拦截,1 / v最大。因此,图4的数据可以用于计算k米通过求解线Y = MX + C的等式,其中M =斜率。

根据方程y = mx + c,线性变换为直线的斜率提供一个值我可以通过Michael Menten方程依次确定每个抑制剂(图6和表1)。

表1:K我值(μM)为抑制剂库。“NI”(无抑制)的值超过1000 μM。灰色值识别低K的总趋势我含有P'1 TRP和Tyr残基的抑制剂的值。
K我(μm) | ||||||||
基本 | 芳香 | 大脂肪族 | 酸性 | |||||
P ' 2 | 利斯河 | arg | ph | TRP. | 瓦 | 鲁 | asp. | Glu |
P ' 1 | ||||||||
他 | 332. | (倪) | 21. | 18. | 47. | 306. | (倪) | (倪) |
arg | 135. | (倪) | 224. | 125. | (倪) | (倪) | 650. | (倪) |
利斯河 | 433. | (倪) | 126. | (倪) | 555. | 123. | 971 | (倪) |
鸢尾 | 190 | (倪) | (倪) | 366. | 1.8 | 1.3 | 142. | (倪) |
ph | 76. | (倪) | 146. | 206. | 11. | 645. | (倪) | (倪) |
鲁 | 14. | 623 | 113. | 300 | (倪) | 53. | 587. | (倪) |
TRP. | 10. | 25. | 1.1 | 49. | 4.1 | 3.7 | 38. | 91. |
翼 | 153. | 115. | (倪) | 395. | 51. | 21. | 316. | (倪) |
遇见 | 3.9 | 6.6 | 867 | 204. | 98. | (倪) | 7.0 | (倪) |
pro | 766. | 56. | (倪) | 562. | 157. | 246. | (倪) | (倪) |
Cys. | 274. | 646. | 131. | 108. | 161. | (倪) | (倪) | (倪) |
asn. | 289. | 280. | 37. | 70 | 180. | 508 | (倪) | (倪) |
瓦 | 22. | 69. | 72. | (倪) | 10. | 69. | (倪) | (倪) |
通用电气 | 451. | 641. | 51. | 122. | 457. | 138. | (倪) | (倪) |
爵士 | (倪) | 444. | 75. | (倪) | 229. | 510. | (倪) | (倪) |
Gln | 380. | 217. | (倪) | 91. | 937 | 540. | (倪) | (倪) |
TYR. | 8.5 | 3.0 | 6.5 | 14. | 0.77 | 33. | 5.5 | 2.7 |
结论
BMG Labtech的酶读者提供了方便的k计算德赢vwin官网客服米,适应性测定优化,多种抑制剂的平行测定,以及测定后数据子集的分离。