酶抑制剂抑制剂组合库的酶动力学测量

介绍

假单胞菌弹性蛋白酶(elastase, pseudolysin, LasB)是条件致病菌分泌的一种金属蛋白酶毒力因子铜绿假单胞菌。作为这种细菌的主要毒力因子之一，它有助于各种疾病状态从囊性纤维化肺的慢性和顽固感染，对皮肤的慢性溃疡有助于各种疾病状态。

LASb的中心作用使其成为该过程中的关键药物靶标，因此开发了一种抑制剂候选物文库以筛选酶。使用来自BMG LabTech的滤光片的微孔板读卡器进行测定，其允许高度适应的数据捕获和平行筛选多种化合物。德赢vwin官网客服数据直接在MARS软件内分析，从而提取了测定后数据的子集。

测定原则

测定原理如图1所示。

内部淬火的蛋白酶衬底Abz-肽-NEBA（2-氨基苯甲酰基 - 甘氨酸-Leu-Ala-4-硝基 - 苄基酰胺）仅提供低荧光信号。在用LASB结合的肽切割后，荧光供体基团不能将能量转移到猝灭受体基团，导致高荧光信号与酶活性直接相关。

材料与方法

• Abz-Ala-Gly-Leu-Ala-Nba(美国多肽国际)
• 贝尔法斯特皇后大学药学院合成的LasB抑制剂图书馆

动态测量
LasB以100 μg/mL原液配制，稀释1 in 1000，每孔10 μL，工作浓度为1 ng /孔。

K_米首先通过测定一系列浓度为20μm至1000μm的一系列浓度来计算底物，抵抗固定浓度的LASb。

抑制剂研究
抑制剂的储备溶液在DMF中配制为10毫米，并在需要时进一步稀释。所使用的仪器设置如下:

不。每孔闪光次数:10次

目标温度:37℃

Ex滤镜:310/10 nm, Em滤镜:460/10 nm

在含有0.05M Tris HCl，2.5mM CaCl 2，1％DMF，pH 7.2的缓冲液中进行所有测定，横跨一系列抑制剂。

结果与讨论

结果可以在图2中可以看出，其次是水解速率Vs衬底浓度的图形显示（图3），以及图4的双倒数或线织机-Burk图。

在Lineweaver-Burk图上这条线的斜率为K_米/ V_最大，而x-拦截给出 - 1 / k_米，以及y-拦截，1 / v_最大。因此，图4的数据可以用于计算k_米通过求解线Y = MX + C的等式，其中M =斜率。

根据方程y = mx + c，线性变换为直线的斜率提供一个值_我可以通过Michael Menten方程依次确定每个抑制剂(图6和表1)。