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酶抑制剂抑制剂组合库的酶动力学测量

George Cathcart Brendan Gilmore Brian Walker 药房学院QUB贝尔法斯特 10/2009
  • 假单胞菌使用ABZ-NBA内部淬火基板监测弹性蛋白酶活性
  • K.m和V.最大限度使用火星数据分析软件计算
  • Michaelis Menten动力学测定了160个弹性蛋白酶抑制剂的图书馆

介绍

假单胞菌Elastase(假谷氨酸,LASB)是由机会理性病原体分泌的金属蛋白酶毒力因子假单胞菌铜绿假单胞菌。作为这种细菌的主要毒力因子之一,它有助于各种疾病状态从囊性纤维化肺的慢性和顽固感染,对皮肤的慢性溃疡有助于各种疾病状态。


LASb的中心作用使其成为该过程中的关键药物靶标,因此开发了一种抑制剂候选物文库以筛选酶。使用来自BMG LabTech的滤光片的微孔板读卡器进行测定,其允许高度适应的数据捕获和平行筛选多种化合物。德赢vwin官网客服数据直接在MARS软件内分析,从而提取了测定后数据的子集。


测定原则

测定原理如图1所示。

内部淬火的蛋白酶衬底Abz-肽-NEBA(2-氨基苯甲酰基 - 甘氨酸-Leu-Ala-4-硝基 - 苄基酰胺)仅提供低荧光信号。在用LASB结合的肽切割后,荧光供体基团不能将能量转移到猝灭受体基团,导致高荧光信号与酶活性直接相关。


材料与方法

  • Abz-Ala-Gly-Leu-Ala-NBA(肽国际,美国)
  • LASB抑制剂图书馆,在贝尔法斯特皇后大学药房学院合成

动力学测量
LASb以100μg/ ml股票的1次以100μg稀释,每孔10μl使用,每孔提供1 ng的LASb的工作浓度。


K.m首先通过测定一系列浓度为20μm至1000μm的一系列浓度来计算底物,抵抗固定浓度的LASb。


抑制剂研究
抑制剂的储备溶液以10mM的DMF制备,并在需要时进一步稀释。所雇用的仪器设置如下:


每孔闪光数量:10


目标温度:37°C


EX Filter:310/10 NM和EM滤波器:460/10 nm


在含有0.05M Tris HCl,2.5mM CaCl 2,1%DMF,pH 7.2的缓冲液中进行所有测定,横跨一系列抑制剂。


成绩与讨论

结果可以在图2中可以看出,其次是水解速率Vs衬底浓度的图形显示(图3),以及图4的双倒数或线织机-Burk图。

LineWeaver-Burk Plot上线的斜率给出了km/ V.最大限度,而x-拦截给出 - 1 / km,以及y-拦截,1 / v最大限度。因此,图4的数据可以用于计算km通过求解线Y = MX + C的等式,其中M =斜率。

根据等式Y = MX + C,线性变换提供了线路的斜率的值。K.一世可以通过Michael Menten方程依次确定每个抑制剂(图6和表1)。

表1:k一世抑制剂库的值(μm)。'Ni'(无抑制)已被陈述超过1000μm的值。灰色的值识别低k的一般趋势一世含有P'1 TRP和Tyr残基的抑制剂的值。

K.一世(μm)
基本的 芳香 大脂肪族 酸性
P'2. Lys. arg ph TRP. asp. glu.
P'1.
他的 332. (你) 21. 18. 47. 306. (你) (你)
arg 135. (你) 224. 125. (你) (你) 650. (你)
Lys. 433. (你) 126. (你) 555. 123. 971. (你)
鸢尾 190 (你) (你) 366. 1.8 1.3 142. (你)
ph 76. (你) 146. 206. 11. 645. (你) (你)
14. 623. 113. 300 (你) 53. 587. (你)
TRP. 10. 25. 1.1 49. 4.1 3.7 38. 91.
153. 115. (你) 395. 51. 21. 316. (你)
遇见 3.9 6.6 867. 204. 98. (你) 7.0 (你)
pro 766. 56. (你) 562. 157. 246. (你) (你)
Cys. 274. 646. 131. 108. 161. (你) (你) (你)
asn. 289. 280. 37. 70 180. 508. (你) (你)
22. 69. 72. (你) 10. 69. (你) (你)
g 451. 641. 51. 122. 457. 138. (你) (你)
(你) 444. 75. (你) 229. 510. (你) (你)
GLN. 380. 217. (你) 91. 937. 540. (你) (你)
TYR. 8.5 3.0 6.5 14. 0.77 33. 5.5 2.7

结论

BMG Labtech的酶读者提供了方便的k计算德赢vwin官网客服m,适应性测定优化,多种抑制剂的平行测定,以及测定后数据子集的分离。

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