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酶抑制剂抑制剂组合库的酶动力学测量

乔治·卡斯卡特,布兰登·吉尔摩,布莱恩·沃克 贝尔法斯特药学院 10/2009
  • 假单胞菌使用ABZ-NBA内部淬火基板监测弹性蛋白酶活性
  • K和V.最大使用火星数据分析软件计算
  • Michaelis Menten动力学测定了160个弹性蛋白酶抑制剂的图书馆

介绍

假单胞菌弹性蛋白酶(elastase, pseudolysin, LasB)是条件致病菌分泌的一种金属蛋白酶毒力因子铜绿假单胞菌。作为这种细菌的主要毒力因子之一,它有助于各种疾病状态从囊性纤维化肺的慢性和顽固感染,对皮肤的慢性溃疡有助于各种疾病状态。


LASb的中心作用使其成为该过程中的关键药物靶标,因此开发了一种抑制剂候选物文库以筛选酶。使用来自BMG LabTech的滤光片的微孔板读卡器进行测定,其允许高度适应的数据捕获和平行筛选多种化合物。德赢vwin官网客服数据直接在MARS软件内分析,从而提取了测定后数据的子集。


测定原则

测定原理如图1所示。

内部淬火的蛋白酶衬底Abz-肽-NEBA(2-氨基苯甲酰基 - 甘氨酸-Leu-Ala-4-硝基 - 苄基酰胺)仅提供低荧光信号。在用LASB结合的肽切割后,荧光供体基团不能将能量转移到猝灭受体基团,导致高荧光信号与酶活性直接相关。


材料与方法

  • Abz-Ala-Gly-Leu-Ala-Nba(美国多肽国际)
  • 贝尔法斯特皇后大学药学院合成的LasB抑制剂图书馆

动态测量
LasB以100 μg/mL原液配制,稀释1 in 1000,每孔10 μL,工作浓度为1 ng /孔。


K首先通过测定一系列浓度为20μm至1000μm的一系列浓度来计算底物,抵抗固定浓度的LASb。


抑制剂研究
抑制剂的储备溶液在DMF中配制为10毫米,并在需要时进一步稀释。所使用的仪器设置如下:


不。每孔闪光次数:10次


目标温度:37℃


Ex滤镜:310/10 nm, Em滤镜:460/10 nm


在含有0.05M Tris HCl,2.5mM CaCl 2,1%DMF,pH 7.2的缓冲液中进行所有测定,横跨一系列抑制剂。


结果与讨论

结果可以在图2中可以看出,其次是水解速率Vs衬底浓度的图形显示(图3),以及图4的双倒数或线织机-Burk图。

在Lineweaver-Burk图上这条线的斜率为K/ V最大,而x-拦截给出 - 1 / k,以及y-拦截,1 / v最大。因此,图4的数据可以用于计算k通过求解线Y = MX + C的等式,其中M =斜率。

根据方程y = mx + c,线性变换为直线的斜率提供一个值可以通过Michael Menten方程依次确定每个抑制剂(图6和表1)。

表1:K值(μM)为抑制剂库。“NI”(无抑制)的值超过1000 μM。灰色值识别低K的总趋势含有P'1 TRP和Tyr残基的抑制剂的值。

K(μm)
基本 芳香 大脂肪族 酸性
P ' 2 利斯河 arg ph TRP. asp. Glu
P ' 1
332. (倪) 21. 18. 47. 306. (倪) (倪)
arg 135. (倪) 224. 125. (倪) (倪) 650. (倪)
利斯河 433. (倪) 126. (倪) 555. 123. 971 (倪)
鸢尾 190 (倪) (倪) 366. 1.8 1.3 142. (倪)
ph 76. (倪) 146. 206. 11. 645. (倪) (倪)
14. 623 113. 300 (倪) 53. 587. (倪)
TRP. 10. 25. 1.1 49. 4.1 3.7 38. 91.
153. 115. (倪) 395. 51. 21. 316. (倪)
遇见 3.9 6.6 867 204. 98. (倪) 7.0 (倪)
pro 766. 56. (倪) 562. 157. 246. (倪) (倪)
Cys. 274. 646. 131. 108. 161. (倪) (倪) (倪)
asn. 289. 280. 37. 70 180. 508 (倪) (倪)
22. 69. 72. (倪) 10. 69. (倪) (倪)
通用电气 451. 641. 51. 122. 457. 138. (倪) (倪)
爵士 (倪) 444. 75. (倪) 229. 510. (倪) (倪)
Gln 380. 217. (倪) 91. 937 540. (倪) (倪)
TYR. 8.5 3.0 6.5 14. 0.77 33. 5.5 2.7

结论

BMG Labtech的酶读者提供了方便的k计算德赢vwin官网客服,适应性测定优化,多种抑制剂的平行测定,以及测定后数据子集的分离。

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