- 使用对硝基苯乙酸乙酸酯(PNPA)测定测定的酯酶活性
- K.m和V.最大使用火星评估软件中的新特征计算
- Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk,以及其他一些情节
表的内容
介绍
酯酶催化水解反应,利用水作为亲核试剂,将酯转化为酸和醇。因此,酯酶属于水解酶的一类。它们经常被用作生物催化剂来生产光学纯化合物。
酯酶的亲和力与特定底物的亲和力不同,并且这种亲和力由Michaelis-menten常数K表示m。它描述了酶对基材的亲和力。K.m相当于反应速度是最大速度的一半的衬底浓度。这意味着对基板的高亲和力导致小km- value和反之亦然。德赢vwin官网客服BMG Labtech开发了一个能够计算k的新评估软件功能m值以及最大速度(v最大)来自酶的动力学测量。在Michaelis-Menten Fit旁边,还显示了其他线性化配合,并给出了结果的比较。
作为模型反应,对硝基苯乙酸酯(pNPA)测定在BMG LABTECH酶标仪上进行。德赢vwin官网客服
测定原理

酶在水的帮助下水解醋酸酯。产品是乙酸和对硝基苯酚(PNP),后者显示出约405nm的吸收最大值。
材料与方法
- 对硝基苯酚(PNP)和P-硝基苯基(PNPA)醋酸乙酸,Sigma Aldrich
- 清除96孔微孔板,Greiner
- 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器
- 火星数据分析软件,1.20版或更高版本
- 由GREIFSWALD教授的工作组友好提供两种不同的酶制剂(E1和E2)
酶动力学测量
制备首先,制备10mm的底物PNPA溶液在DMSO中。在每个阱中,引发了190μl磷酸盐缓冲液(50mM,pH7.4)和10μl酶制剂。使用船上注射器添加不同浓度的40μl底物(在DMSO中溶解)。每个孔的最终体积为240μl。酶反应加入底物后开始。在37℃下每秒测量410nm,每秒测量吸光度90秒。坯料表示没有酶的PNPA的自动水解。此外,仅由缓冲液和酶组成的不含PNPA阴性对照(NC)。
使用井模式(参见下面的仪器设置)进行测量,这提供了注入和测量吸光度的可能性。
仪器设置
测量类型: | 吸光度,井模式 |
不。时间间隔: | 90 |
动力学间隔时间: | 1秒钟 |
不。每口井闪光次数: | 20. |
定位延迟: | 0.5秒 |
目标温度: | 37℃ |
过滤器: | 410-10 nm. |
注射设置
泵1和2的体积: | 个人 |
泵速: | 310μl / s |
注射开始时间: | 2.0秒 |

pNP型标准曲线
为了计算初始反应速率,必须将每分钟的δOD值转化为每分钟μmol产物。因此,必须使用与动力学测量相同的反应条件的产品的标准曲线。从10mM PNP储备溶液中,在磷酸盐缓冲液(50mM,pH7.4)中,不同的PNP稀释液在200μL中制备0.0025μmol至0.1μmol。加入40μLDMSO,在动力学样品中模拟DMSO浓度。使用吸光度410-10nm过滤器测量光密度(OD)。图3显示了PNP标准曲线。

在上述条件下,标准曲线的斜率表示pNP的消光系数。其浓度约为41 OD / μmol。该系数用于计算初始反应速度。
结果与讨论
在完成酶动力学测量后,评估软件提供不同的地块,并呈现相应的KM和V最大价值观。MICHAELIS-MENTEN FIT表示根据基材浓度的反应速度(图4)。

在Michaelis-Menten旁边,配合不同的线性化图。图5示出了这种线性化图(Hanes Plot)。

将进一步线性化拟合的结果与表1中的Michaelis-Menten结果进行比较。
表1:km和V.最大从不同酶动力学图中获得的比较。
情节 | E1. | E2. | ||
K.m[μmol] | V.最大[μmol/ min] | K.m[μmol] | V.最大[μmol/ min] | |
Michaelis-Menten | 0.056 | 44.8 | 0.12 | 16.3 |
Lineweaver-Burk. | 0.073 | 49.2 | 0.08 | 12.5 |
eadie-hofstee | 0.063 | 46.4 | 0.07 | 13.2 |
刮刀 | 0.068 | 47.9 | 0.10 | 15.2 |
汉诺斯 | 0.056 | 44.4 | 0.11 | 15.5 |
确定k的不同方法m和V.最大拥有所有资产和缺点。因此,建议看看不同的曲线,以确定哪个计算常数真正正确。在MARS数据分析的帮助下,软件酶动力学评估非常简单,因为每种曲线都可以直接在测量和计算后获得。
结论
酶动力学的新软件功能提供快速简便的km和V.最大。可用的地块是普通的Michaelis-Menten,LineWeaver-Burk,Eadie-Hofstee,Scatchard和Hanes动力学。