在BMG Labtech微孔板读卡器上进行了酶动力学测量德赢vwin官网客服

介绍

酯酶催化水解反应，利用水作为亲核试剂，将酯转化为酸和醇。因此，酯酶属于水解酶的一类。它们经常被用作生物催化剂来生产光学纯化合物。

酯酶的亲和力与特定底物的亲和力不同，并且这种亲和力由Michaelis-menten常数K表示_m。它描述了酶对基材的亲和力。K._m相当于反应速度是最大速度的一半的衬底浓度。这意味着对基板的高亲和力导致小k_m- value和反之亦然。德赢vwin官网客服BMG Labtech开发了一个能够计算k的新评估软件功能_m值以及最大速度（v_最大）来自酶的动力学测量。在Michaelis-Menten Fit旁边，还显示了其他线性化配合，并给出了结果的比较。

作为模型反应，对硝基苯乙酸酯(pNPA)测定在BMG LABTECH酶标仪上进行。德赢vwin官网客服

测定原理

酶在水的帮助下水解醋酸酯。产品是乙酸和对硝基苯酚（PNP），后者显示出约405nm的吸收最大值。

材料与方法

• 对硝基苯酚（PNP）和P-硝基苯基（PNPA）醋酸乙酸，Sigma Aldrich
• 清除96孔微孔板，Greiner
• 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器
• 火星数据分析软件，1.20版或更高版本
• 由GREIFSWALD教授的工作组友好提供两种不同的酶制剂（E1和E2）

酶动力学测量
制备首先，制备10mm的底物PNPA溶液在DMSO中。在每个阱中，引发了190μl磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.4）和10μl酶制剂。使用船上注射器添加不同浓度的40μl底物（在DMSO中溶解）。每个孔的最终体积为240μl。酶反应加入底物后开始。在37℃下每秒测量410nm，每秒测量吸光度90秒。坯料表示没有酶的PNPA的自动水解。此外，仅由缓冲液和酶组成的不含PNPA阴性对照（NC）。

使用井模式（参见下面的仪器设置）进行测量，这提供了注入和测量吸光度的可能性。

仪器设置

测量类型：	吸光度，井模式
不。时间间隔:	90
动力学间隔时间：	1秒钟
不。每口井闪光次数:	20.
定位延迟：	0.5秒
目标温度：	37℃
过滤器:	410-10 nm.

注射设置

泵1和2的体积：	个人
泵速：	310μl / s
注射开始时间：	2.0秒

pNP型标准曲线
为了计算初始反应速率，必须将每分钟的δOD值转化为每分钟μmol产物。因此，必须使用与动力学测量相同的反应条件的产品的标准曲线。从10mM PNP储备溶液中，在磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.4）中，不同的PNP稀释液在200μL中制备0.0025μmol至0.1μmol。加入40μLDMSO，在动力学样品中模拟DMSO浓度。使用吸光度410-10nm过滤器测量光密度（OD）。图3显示了PNP标准曲线。

在上述条件下，标准曲线的斜率表示pNP的消光系数。其浓度约为41 OD / μmol。该系数用于计算初始反应速度。

结果与讨论

在完成酶动力学测量后，评估软件提供不同的地块，并呈现相应的KM和V_最大价值观。MICHAELIS-MENTEN FIT表示根据基材浓度的反应速度（图4）。

在Michaelis-Menten旁边，配合不同的线性化图。图5示出了这种线性化图（Hanes Plot）。