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在BMG Labtech微孔板读卡器上进行了酶动力学测量德赢vwin官网客服

法兰卡甘克 德赢vwin官网客服 04/2009
  • 使用对硝基苯乙酸乙酸酯(PNPA)测定测定的酯酶活性
  • K.m和V.最大使用火星评估软件中的新特征计算
  • Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk,以及其他一些情节

表的内容

介绍

酯酶催化水解反应,利用水作为亲核试剂,将酯转化为酸和醇。因此,酯酶属于水解酶的一类。它们经常被用作生物催化剂来生产光学纯化合物。


酯酶的亲和力与特定底物的亲和力不同,并且这种亲和力由Michaelis-menten常数K表示m。它描述了酶对基材的亲和力。K.m相当于反应速度是最大速度的一半的衬底浓度。这意味着对基板的高亲和力导致小km- value和反之亦然。德赢vwin官网客服BMG Labtech开发了一个能够计算k的新评估软件功能m值以及最大速度(v最大)来自酶的动力学测量。在Michaelis-Menten Fit旁边,还显示了其他线性化配合,并给出了结果的比较。


作为模型反应,对硝基苯乙酸酯(pNPA)测定在BMG LABTECH酶标仪上进行。德赢vwin官网客服


测定原理

酶在水的帮助下水解醋酸酯。产品是乙酸和对硝基苯酚(PNP),后者显示出约405nm的吸收最大值。


材料与方法

  • 对硝基苯酚(PNP)和P-硝基苯基(PNPA)醋酸乙酸,Sigma Aldrich
  • 清除96孔微孔板,Greiner
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器
  • 火星数据分析软件,1.20版或更高版本
  • 由GREIFSWALD教授的工作组友好提供两种不同的酶制剂(E1和E2)

酶动力学测量
制备首先,制备10mm的底物PNPA溶液在DMSO中。在每个阱中,引发了190μl磷酸盐缓冲液(50mM,pH7.4)和10μl酶制剂。使用船上注射器添加不同浓度的40μl底物(在DMSO中溶解)。每个孔的最终体积为240μl。酶反应加入底物后开始。在37℃下每秒测量410nm,每秒测量吸光度90秒。坯料表示没有酶的PNPA的自动水解。此外,仅由缓冲液和酶组成的不含PNPA阴性对照(NC)。


使用井模式(参见下面的仪器设置)进行测量,这提供了注入和测量吸光度的可能性。

仪器设置

测量类型: 吸光度,井模式
不。时间间隔: 90
动力学间隔时间: 1秒钟
不。每口井闪光次数: 20.
定位延迟: 0.5秒
目标温度: 37℃
过滤器: 410-10 nm.

注射设置

泵1和2的体积: 个人
泵速: 310μl / s
注射开始时间: 2.0秒

pNP型标准曲线
为了计算初始反应速率,必须将每分钟的δOD值转化为每分钟μmol产物。因此,必须使用与动力学测量相同的反应条件的产品的标准曲线。从10mM PNP储备溶液中,在磷酸盐缓冲液(50mM,pH7.4)中,不同的PNP稀释液在200μL中制备0.0025μmol至0.1μmol。加入40μLDMSO,在动力学样品中模拟DMSO浓度。使用吸光度410-10nm过滤器测量光密度(OD)。图3显示了PNP标准曲线。

在上述条件下,标准曲线的斜率表示pNP的消光系数。其浓度约为41 OD / μmol。该系数用于计算初始反应速度。


结果与讨论

在完成酶动力学测量后,评估软件提供不同的地块,并呈现相应的KM和V最大价值观。MICHAELIS-MENTEN FIT表示根据基材浓度的反应速度(图4)。

在Michaelis-Menten旁边,配合不同的线性化图。图5示出了这种线性化图(Hanes Plot)。

将进一步线性化拟合的结果与表1中的Michaelis-Menten结果进行比较。

表1:km和V.最大从不同酶动力学图中获得的比较。

情节 E1. E2.
K.m[μmol] V.最大[μmol/ min] K.m[μmol] V.最大[μmol/ min]
Michaelis-Menten 0.056 44.8 0.12 16.3
Lineweaver-Burk. 0.073 49.2 0.08 12.5
eadie-hofstee 0.063 46.4 0.07 13.2
刮刀 0.068 47.9 0.10 15.2
汉诺斯 0.056 44.4 0.11 15.5

确定k的不同方法m和V.最大拥有所有资产和缺点。因此,建议看看不同的曲线,以确定哪个计算常数真正正确。在MARS数据分析的帮助下,软件酶动力学评估非常简单,因为每种曲线都可以直接在测量和计算后获得。


结论

酶动力学的新软件功能提供快速简便的km和V.最大。可用的地块是普通的Michaelis-Menten,LineWeaver-Burk,Eadie-Hofstee,Scatchard和Hanes动力学。

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